三代测序将为转录组研究者带来哪些惊喜?

三代测序将为转录组研究者带来哪些惊喜?

   前沿导读   

随着第二代基因测序技术的发展,对生物样本的转录组测序也日趋成熟。科学家对所研究的样本进行转录组测序,探究不同品系、不同外界条件处理、不同发育时期、不同组织或不同细胞之间的基因表达差异。利用二代测序平台的转录组测序技术还可针对基因结构进行研究,如发现cSNP、SSR、预测ORF等。

二代测序技术的优势在于通量高,能比较精确地反映不同样本之间的基因表达差异,但基于读长的限制,在文库构建过程中需要对mRNA样本进行打断,并在信息分析过程中进行重新拼接,这样就会导致存在一定的误差;另外,对于测序结果中的5’端和3’端的信息不完整,往往得不到mRNA的全长序列。

基于利用二代测序平台进行转录组测序的弊端,派森诺生物自主研发利用三代测序平台(PacBio RS II平台)进行全长转录组测序的项目,并取得了成功。通过对一种无参考基因组的植物样本的转录组测序,获得了该物种大量的mRNA全长序列。全长mRNA的获得,将为广大的科研工作者提供更好的技术支持。在很多科研项目中,尤其涉及到基因功能的研究,需要获得靶基因的mRNA全长序列,对于基因组序列未知的物种,需要通过RACE(cDNA末端快速扩增)技术来获得mRNA全长,而该方法技术难点高,实验周期长,往往成为获得靶基因mRNA全长序列的瓶颈。基于三代测序平台的全长转录组测序,将很好地解决这一技术问题,通过该技术获得大量的mRNA全长序列,科学家可以从中选取感兴趣的基因进行后续研究。


   技术简介   

下面,将针对全长转录组测序技术进行介绍。

将生物学样本进行总RNA的提取并反转录,合成cDNA并加接头序列;根据片段大小将cDNA进行分割,进行PCR扩增;将cDNA进行环化处理,并上机测序。流程如下:

三代转录组测序分析流程图


就下机后的数据进行生物信息学分析,分析流程如下:


  • 处理下机数据,得到Reads Of Insert(即CCS: Circular consensus sequences);
  • 检测序列是否包含5’末端、3’末端引物和polyA尾巴,区分全长序列和非全长序列;
  • 对全长序列进行Isoform水平聚类,并使用非全长序列对聚类的Isoform进行质量校正,根据校正后的Isoform碱基质量,将结果分为高质量和低质量的序列;
  • 分别对高质量和低质量序列进行去冗余处理,并计算每个样本中每个转录本在全长和非全长序列上的覆盖度;
  • 对得到的转录本序列进行NR、GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot等功能注释。

三代转录组测序分析流程图



   三代测序平台横空出世   

目前,基于三代测序平台的技术特点,可获得指定片段长度范围内的mRNA序列全长,对广大科研工作者的科学研究起到了重要的推动作用。关于全长转录组测序的具体技术问题和拟解决的科学问题,欢迎广大科研工作者访问我公司网站http://www.personalbio.cn/,或拨打公司电话4009-202-898进行咨询,公司将由负责RNA测序的产品经理,就您所关注的问题进行详细解答。

此外,派森诺生物于今年初同加利福尼亚太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio)合作,购入第三代单分子基因测序系统——Sequel,Sequel测序系统作为PacBio RS II测序系统的升级产品,测序通量有了大幅度提升,将满足更多的科研工作者的科研需求。