2017-12-27
1. 研究背景
家山黧豆，作为人类的食物及动物的饲料，最早可追溯到新石器时代。长期以来，因其营养丰富，具有耐旱、耐涝、耐寒等优良生产性状,广受世界各地的青睐。特别是在大旱年份，在其它粮食作物绝收的情况下，仍有较好的收成，因此，被视为干旱及半干旱地区首选的优良作物，但由于其拥有较大的基因组（8.2Gb），易发生外交，并且含有神经细胞毒性物质L-β-L-酰二氨基丙酸（ODAP），过量食用会引起下肢痉挛性瘫痪等原因，使家山黧豆的种植受到限制。目前国内外对于该种作物的研究也较少。可喜的是，今年（2017年）10月在Frontier in Plant Science（IF = 4.298）这一期刊上发表了一篇关于家山黧豆的文章。这篇文章主要是通过Illumina NextSeqTM 500测序平台从基因层面来揭开家山黧豆的神秘面纱。
2. 实验内容
2.1 对非洲和欧洲的家山黧豆幼苗期的根，茎和叶的混合样进行转录组测序分析
表1 trinity软件对家山黧豆转录组数据的de novo组装
图1 家山黧豆unigene的Nr, GO, KEGG, eggNOG, Swissport 数据库的注释分布
如表1所示，家山黧豆测得142053个转录本，经过拼接得到27431个Unigene。这27431个Unigene分别和NR，GO，KEGG，eggNOG以及Swissprot五种蛋白数据库进行比对，发现27431个Unigene 100%比对到NR数据库中家山黧豆的蛋白序列信息，约72.4%比对到Swissprot数据库（图1）。
图2 家山黧豆unigene的GO功能注释分布
图3 家山黧豆unigene的eggNOG功能注释分布
图4 家山黧豆unigene的KEGG功能注释分布
通过对unigene进行功能注释，发现在GO（图2）中大多数基因主要功能为生物过程中的代谢过程，细胞成分中的细胞和分子功能中的结合。在eggNOG（图3）功能注释中大多数基因主要聚类于的细胞功能未知功能和通用功能预测；在KEGG（图4）中大多数基因注释为糖代谢，转录，信号转导，细胞生长和死亡，内分泌系统以及传染性疾病。
将注释到的家山黧豆的c39901_g1_il基因与近亲——豌豆的SGR基因进行比对（图5），发现二者具有高度的一致性，并且功能类似，所以家山黧豆中的c39901_g1_il基因是豌豆SGR基因的同系物。这些转录组数据对于家山黧豆的基因的进一步挖掘和分子育种有着极大的帮助。
图5 家山黧豆c39901_g1_il基因与豌豆的SGR基因蛋白序列比对结果
2.2 对43种家山黧豆进行SSR和KASP标记物的检测
SSR是种植资源评价和有效繁殖的强有力的标志之一，国内外众多研究小组在很多领域中使用这种分子工具，如基因多样性，DNA指纹、遗传连锁图谱、QTL映射和等位基因等研究领域。本篇文章作者通过使用微卫星识别工具对两种家山黧豆的转录组测序结果进行SSR高通量筛选，筛选出含有SSR的序列后，根据其侧翼设计引物。对43种家山黧豆幼苗期的叶子进行基因组DNA提取，进行PCR，产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后硝酸银染色。最终确定了87个多态性引物和88个单态性引物。
对于SNP的检测，目前存在很多种方法，例如等位基因特异性PCR，荧光定量检测，分子信标与基因芯片SNP基因分型等，但这些方法均价格昂贵，而KASP作为一种新型的强有力的的SNP检测方法，有着其他方法不可比拟的优势，结果精准，效率高，价格亲民，使得这一方法发展迅速。本篇文章对筛选出的146406 个SNP 随机挑选50个SNP 基因座，使用KASP技术进行验证，发现其中42个SNP基因座可作为KASP标志物，其中2个是单态性的，40个是多态性的。根据这一结果可以发现，较高比例的SNP可以作为KASP标志物，那么未来可以将特定特征的SNP作为KASP标志物确定的参考目标。
使用两种计算方法对43个家山黧豆的87个SSR和42个KASP标志物制作系统树状图（图6）。虽然这两种计算方法得到的系统树状图存在细小差别，但所有组别之间的关系是相似的。SSR和KASP标志物的结果对于评估家山黧豆基因的遗传多样性有着非常重要的作用，同时也为家山黧豆的基因改良育种提供理论参考。
图6 家山黧豆SSR和KASP标志物系统树状图
本研究的测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
参考文献：
X Hao, T Yang, R Liu, J Hu, Y Yao, & M Burlyaeva, et al. (2017). An rna sequencing transcriptome analysis of grasspea (lathyrus sativus l.) and development of ssr and kasp markers. Frontiers in Plant Science, 8, 1873.
