RNA 甲基化指发生在RNA 分子上不同位置的甲基化修饰现象，常见的RNA转录后修饰方式有6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)。

研究发现，m6A修饰在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。因此MeRIP-seq助力解决细胞分化、生物发育、疾病发生发展、热休克反应等生物学问题。

利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技术，可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行研究，是表观转录组学研究的关键技术。

RNA甲基化简介

表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalenthistone modification)、DNA 甲基化修饰(DNAmethylation)、RNA 甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(genesilencing)、RNA 编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化。RNA 甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA 分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6- 甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine， m6A)是真核生物中常见的RNA 转录后修饰。RNA 甲基化在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA 甲基化，RNA 甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高等生物中。

m⁶A修饰的机制与功能

m6A 甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生，目前已知这个复合物的成分包括METTL3，METTL14 和 WTAP；去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5则负责擦除甲基化修饰基团。在细胞核中的 HNRNPC 负责识别m6A修饰基团，并介导mRNA前体的选择性剪接。而另外一个m6A识别蛋白 HNRNPA2B1则促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在细胞质中，不同的 m6A 位点识别蛋白介导不同的功能。YTHDF1 和YTHDF3识别 m6A 修饰 mRNA，通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译，eIF3识别蛋白也会直接绑定到 mRNA 5’UTR 端的 m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白 YTHDF2 与 m6A 的结合将导致 mRNA 的降解。

甲基化测序技术原理

MeRIP-seq 测序文库制备过程如下：首先从样本细胞组织中分离出RNA，考虑到总RNA 中含有大量的rRNA 序列，因此需要结合不同的方法去除其中的rRNA。对于真核生物而言，常采用Poly(T)寡核苷酸提取出带Poly(A)的RNA 去除rRNA；而对不含Poly(A)尾的转录本序列以及存在部分降解的总RNA 样本而言，需要试剂盒去除rRNA，从而得到除rRNA 外的全部RNA，然后将提取出的RNA 随机打断。MeRIP-seq 技术对带有甲基化修饰的片段（IP 样本）进行测序时，需要平行对一个对照样本（Control 样本）进行测序， 其IP 样本和Control 样本的片段选择方法主要有以下2 种：a．将打断的RNA 片段分成两份，一份直接用于制备Control 样本的cDNA 文库，另一份采用抗m6A抗体与被打断的RNA 进行孵育，抓取带有m6A 修饰的片段，用于制备IP 样本的cDNA 文库．由于测序得到的结果不以所有RNA 片段为背景，称这样得到的IP 样本和Control 样本是非成对的（unpair），在进行数据处理时需先对Control 样本进行处理。b．取两份相同的RNA 进行打断，其中一份所有的RNA 片段都进行测序，作为Control样本，另一份采用抗m6A 抗体抓取带有m6A 修饰的片段进行测序作为IP 样本。由于测序得到的IP样本背景为当前测序得到的Control 样本，称这样得到的IP 样本和Control 样本是成对的(pair)，可直接用于数据处理。获取测序片段后（包括IP 样本测序片段和Control 样本测序片段)，用随机引物和反转录酶从RNA 片段合成双链cDNA。然后，对合成的cDNA进行末端修复并在3′端加“A”，使用特定测序接头(adapter)连接cDNA 片段两端，从而得到用于测序的cDNA。通常情况下，为了得到更高的测序效率，一般采用电泳切胶法获取一定长度的cDNA，再对其进行PCR 扩增，得到所需的cDNA 文库。

实验设计

实验组VS对照组，建议3-5:3-5

组内对照：IP组VS in put组（input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是常备的组分）

测序模式：PE150

数据量：20M clean reads

项目周期：50天