2024-03-19
单细胞测序是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术，为基础科学研究、药物研发、肿瘤治疗与未来的临床疾病研究提供了强有力的工具。在医学研究领域，随着单细胞测序技术的不断更新和发展，其在揭示微环境中细胞群体间的关系、追踪疾病发生发展等研究中发挥着越来越重要的作用，后续可为个性化疾病预防、治疗提供技术支持。今天我们就对近期在风湿病领域顶级期刊《Annals of the Rheumatic Diseases》（IF：27.4）发表的文章进行解析，看单细胞测序技术如何为狼疮性肾炎精准治疗提供新思路。
研究背景 狼疮性肾炎（lupus nephritis, LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）最常见及严重的并发症之一，约有50-80% SLE患者具有LN临床表现，10-20%患者发展为终末期肾脏病（end stage kidney desease, ESKD），许多患者对免疫治疗和其它治疗方式无反应。尽管目前已经鉴定了多种临床诊断标志物，如尿蛋白-肌酸酐比值、尿TGF-β等都不能独立使用。LN患者的肾脏通常具有包括浆细胞、Th1、Th17和杀伤性CD8+T细胞等多种免疫细胞浸润，但目前参与LN疾病的关键免疫细胞还不清楚。研究表明，LN肾脏中存在高度复杂的免疫微环境，肾脏的固有细胞与免疫细胞协同参与LN肾脏的炎症反应，肾脏固有细胞不仅仅是LN炎症损伤的靶细胞，还可通过分泌炎症介质、改变代谢方式等方式影响免疫细胞的功能状态，促进肾脏炎性微环境的形成。故探究LN的肾脏微环境中免疫细胞和固有细胞的组成、分子特征以及细胞间的相互作用对研究LN的发生进展机制具有非常重要的意义。
研究结果 一、LN肾脏单细胞图谱及疾病相关细胞亚群的鉴定 为了解析LN肾脏微环境并鉴定与LN相关的细胞类型，本研究对40例LN患者（包括36例初治患者和4例复发患者）和6例正常肾活检穿刺标本进行单细测序，其中取33例LN患者和6例健康对照的肾穿刺样本做单细胞转录组测序（scRNA-seq），7例LN患者同时取肾穿刺和外周血样本做单细胞转录组测序（scRNA-seq）联合单细胞TCR测序（scTCR-seq），具体见图1.1。 图1.1 单细胞方案设计总览 本研究从46例（LN=40, HC=6）临床肾穿刺样本共获得26,8942个高质量细胞，聚类后共注释为6大类细胞，分别是：B cells、T cells、髓系细胞（myeloid cells）、 内皮细胞（endothelial cells）、上皮细胞（epithelial cells）和间充质细胞（mesenchymal cells）（图1.2B）。细胞比例分析发现LN组中B细胞、T细胞、髓系细胞和间充质细胞的比例显著高于HC组，而上皮细胞的比例显著低于HC组（图1.2C、D）。此外，发现T细胞和髓系细胞的比例与疾病严重程度呈正相关（图1.2E）。本研究继续做各细胞亚型与其临床参数之间的相关性分析，发CT03_CD4_IL17A、 CM02_CDC2_CD1C和CEpi04_IPTEC_SOX9与24小时尿蛋白定量（24h-Upro）呈正相关，与肾小球滤过率（eGFR）呈负相关，其中CDC2s与24h-Upro和eGFR的相关性最强（图1.2F）。 图1.2 LN肾脏单细胞图谱及疾病相关细胞亚群的鉴定 二、LN患者肾脏cDC2s的异质性分析 cDC2s作为前哨细胞，在启动和维持适应性免疫反应中发挥关键作用。为了探究LN患者肾脏微环境中cDC2s的异质性，本研究对其进行亚群细分，根据经典marker基因表达，共注释了四个亚群：C0_DC3、C1_mo-DC、C2_DC2和C3_AS-DC，只有亚群C0_DC3与24h-Upro呈正相关，与eGFR呈负相关（图2A-D），提示DC3s作为cDC2s的组成部分，可能在LN的发病机制中起重要作用。流式和免疫荧光验证了DC3s存在于LN患者肾脏中，而健康肾脏中几乎检测不到它的存在（图2E、F）。 图2. LN患者肾脏cDC2s的异质性分析 三、LN患者肾DC3s表现出激活和促炎表型 本研究对来源于肾脏样本和血液样本的cDC2s细胞进行亚群细分，共得到6个亚群（图3A）。基因集和基因表达分析发现LN患者肾脏DC3s表现出促炎和抗原呈递能力强的特征（图3B、C）。转录因子分析发现与DC成熟/激活相关的转录因子，如STAT4和RELB，只在肾脏DC3s中被特异激活（图3D）。拟时轨迹分析发现LN患者肾脏DC3s细胞可能来源于外周血或从肾脏DC分化而来（图3E-G）。 图3. LN患者肾脏DC3s表现出激活和促炎表型 四、肾脏DC3s可作为LN患者治疗反应的潜在生物标志物 基于肾脏DC3s与疾病严重程度的临床相关性，LN患者肾脏DC3s浸润程度是否与治疗反应相关呢？在纳入研究的40名LN患者中，19名完成了为期6个月的免疫抑制剂和糖皮质激素治疗的诱导治疗，并在治疗前对他们的肾脏活检样本进行了单细胞测序。在这19名患者中，13名患者获得完全缓解（称为“Responder”），6名患者获得不完全缓解（称为“Non-responder”），细胞比例分析及多重免疫荧光验证和密度分析发现，与Responder相比，Non-responder肾脏DC3s的比例和密度明显更高（图4A-C）。通过单变量和多变量逻辑回归分析，本研究确定了肾脏DC3s是一个独立的预测因子，能够预测LN患者对诱导治疗的反应（图4D-F）。 图4. 肾脏DC3可作为LN患者治疗反应的潜在生物标志物 五、LN患者肾脏DC3s促进肾内CD4+T细胞活化 功能富集分析发现，与其他cDC2亚群相比，LN患者肾脏中的DC3s细胞表现出更强的T细胞活化功能（图5A）, 提示LN患者肾脏DC3s促进局部T细胞活化。为探究肾脏DC亚群和T细胞亚群之间的相互作用，本研究检测了其配体-受体(L-R)对的数量。结果表明，与其他DC亚群相比，肾脏DC3s细胞与CD4+和CD8+T细胞的相互作用增强（图5B）。单细胞转录组联合TCR分析得出在LN患者肾脏的CD4+和CD8+T细胞亚群中，Th1（cT02_Th1_IFNG）、GZMK+（cT07_CD8_GZMK）和GZMB+（cT08_CTL_GZMB）细胞毒性T细胞的克隆性增殖水平较高，而在LN患者血液中的激活的效应记忆CD4+T细胞（称为Temra细胞，bT04_Temra_CD4)、GZMK+（bT06_CD8_GZMK）和GZMB+细胞毒性CD8+T细胞表现出高水平的克隆扩增（图5C、D）。这些观察结果提出了一种可能性，即CD4+ T细胞可能在肾脏内被激活，而CD8+ T细胞在血液中被激活，随后浸润肾脏，在LN发病过程中促进T细胞反应。综上所述，肾脏DC3s可能作为关键抗原呈递细胞（APC），促进肾内Th17和Th1细胞的激活和极化，从而促进LN肾脏的肾脏炎症反应（图5E-H）。 图5. LN患者肾脏DC3s促进肾内CD4+T细胞活化
研究总结 本研究通过单细胞测序全面解析了狼疮性肾炎（LN）患者肾脏微环境，首次揭示了肾脏CD163+DC细胞是参与疾病的关键免疫细胞，可作为LN患者诱导治疗6个月的疗效预测标志物，为LN的精准治疗提供潜在靶点和思路。
