2024-04-16
作为单细胞高级分析之一的拟时轨迹分析，在进行细胞动态发育，或者细胞状态分化过程研究中，利用拟时轨迹分析可模拟细胞动态过程，获得细胞发育的方向以及状态，同时也有助于获得处于中间态的细胞类型。常见的有monocle拟时序分析、RNA velocity细胞速率、Palantir拟时序分析、CytoTRACE细胞分化潜能、PAGA轨迹推断等，下面随小派看看拟时轨迹分析在单细胞研究中的应用思路吧~
应用1、挖掘细胞分化的关键调控基因 项目文章：Single-cell transcriptomes and runx2b-/- mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish 发表期刊：National Science Review（IF：20.6） 科学问题：鱼类肌间刺是如何形成的？关键的调控基因有哪些？ 拟时轨迹分析流程及结果描述： Step 1:鉴定肌肉组织细胞类型：取 60dpf 野生型斑马鱼的尾部肌肉组织，解离单细胞，进行单细胞转录组测序，根据经典marker基因表达鉴定到18类细胞（图A）。 Step 2: 挑选与肌间刺形成相关的细胞群：根据已有的研究报道, 成骨细胞和肌腱相关细胞群（肌腱祖细胞、成熟肌腱细胞、分化中肌腱细胞 ）与肌间刺形成具有潜在的分化关系，利用拟时序分析算法之一monocle2对这4类细胞进行拟时序分析,发现4类细胞分别排列在拟时序轨迹的的不同位置：肌腱祖细胞位于分化起点，分化中肌腱细胞位于中间，而成骨细胞和成熟肌腱细胞分别位于2个分化末端。 Step 3: 获得分化轨迹中动态变化的基因集：以肌腱祖细胞为起始点，获得细胞向两个方向分化时的基因动态变化热图，一共获得3个具有不同表达变化趋势的模块基因，从这三个模块基因集中共鉴定到10个可能与肌间刺形成相关的基因：其中7个基因（ runx2a, runx2b, bmp2a, scpp1, spp1, entpd5a, entpd5b ）的表达在肌腱祖细胞中表达低，而在成骨细胞中表达高，3个基因（sost, sox11b, ccn4b）在肌腱祖细胞中高表达，而在成骨细胞和成熟肌腱细胞中表达较低。 基因功能验证：在斑马鱼中利用CRISPR-Cas9方法对这10个基因分别进行敲除，发现entpd5a-/-(40dpf)和runx2b-/-突变体完全缺乏肌间刺的形成。其中entpd5a-/-突变体在40dpf时死亡，runx2b-/-突变体正常存活，该基因的鉴定为生产无肌间刺的商业鱼类品种奠定基础。
应用2、判断Novel细胞类型的发育状态 文献：Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease 发表期刊：Science （IF：56.9） 科学问题：肾脏组织包含哪些细胞类型？以及它们的功能？ 拟时轨迹分析流程及结果描述： Step 1:鉴定肾脏组织细胞类型：取7例健康小鼠完整肾组织，解离单细胞，进行单细胞转录组测序，根据经典marker基因表达鉴定到17类细胞，其中一类细胞（cluster 8）具有独特的转录特征：同时表达两类细胞（主细胞和闰细胞）的marker基因，并且具有特异表达的基因，为了进一步研究该细胞类型（图A）。 Step 2: 挑选与cluster 8相关的细胞群，利用拟时序分析算法monocle2对cluster6, 主细胞（PC）, 闰细胞（IC）这3类细胞进行拟时序分析,发现cluster8位于主细胞和闰细胞的中间位置，表明cluster8是一类过渡态细胞； 拟时序结果验证：构建谱系标签小鼠Aqp2CremT/mG和Aqp2CremT/mG，分别标记分化中的主细胞和闰细胞，多重免疫荧光染色发现存在一类细胞是AQP2和ATP6V1B1“双阳性”细胞，与单细胞研究结果吻合。
应用3 辅助判断细胞注释的准确度 文献：Single-cell transcriptome analysis reveals aberrant stromal cells and heterogeneous endothelial cells in alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head 发表期刊：Communications Biology （IF：5.9） 科学问题：探究中期和晚期股骨头坏死（ONFH）患者股骨组织的转录图谱。 拟时轨迹分析流程及结果描述： Step 1:鉴定股骨组织细胞类型：取患者和健康对照组的股骨组织，解离单细胞，进行单细胞转录组测序，根据经典marker基因表达鉴定到4大类细胞—髓系细胞、淋巴细胞、内皮细胞、基质细胞，其中基质细胞包含5个亚群：未分化的基质细胞（USCs）、纤维软骨细胞（FCs）、成脂谱系细胞（ALCs）、成骨谱系细胞（OLCs）、软骨谱系细胞（CLCs）,其中一些亚群的特征基因呈现出非特异的表达。 Step 2: 挑选感兴趣的细胞亚群：为了证实上一步中基于marker基因对基质细胞亚群注释的准确性，利用拟时序分析算法monocle2对基质细胞的5个亚群进行拟时序分析，发现未分化的基质细胞（USCs）位于拟时轨迹的分化起点，经历2次细胞命运的转变分别形成脂肪、成骨和软骨。用于判定细胞亚群的marker基因表达峰值出现在拟时轨迹的不同位置，与细胞命运的判定是一致的。 Step 3: 获得分化轨迹中动态变化的基因集：分别以拟时轨迹中的2个分支点为中心，获得随着分支点细胞向不同方向分化时呈现出不同表达趋势的基因集，发现已知的谱系特异性基因(ADIRF, IBSP, SPP1)表达趋势与细胞命运一致，进一步证实了细胞注释的准确性。
