2024-04-26
近些年来，随着单细胞测序技术测序通量的提高以及测序成本的降低，单细胞测序技术在医药、农学等各个领域如火如荼地开展着，其中水产生物单细胞主要在生物进化、免疫调控等领域被广泛应用，下面通过4篇文献来助您打开单细胞测序在水产研究中的应用思路~
一、单细胞转录组测序揭示斑马鱼肌间刺形成的遗传特征 派森诺项目文章 发表期刊：National Science Review 影响因子：23.178 发表时间：2022.08 合作单位：华中农业大学水产学院 研究背景 肌间刺 (IBs) 是一种矿化的针状体，存在于许多鱼类肌隔中，但不是所有的硬骨鱼物种都有。IBs 通常又 小又尖锐，因此限制了鱼的加工方式，如果它卡在消费者的喉咙或嘴里，会造成伤害或创伤，从而影响鱼对许 多消费者的吸引力。硬骨鱼 IBs 的发育机制和分子基础目前尚未完全了解，仍有待研究。已有研究证明，IBs 起源于肌间隔肌腱的膜内骨化。在哺乳动物中，肌腱祖细胞的成骨分化能力已被确定，但硬骨鱼从肌腱祖细胞 到成骨细胞分化的分化模式和分子机制尚不清楚。 研究材料 本研究取 60dpf 野生型斑马鱼的尾肌进行单细胞转录组测序。 研究思路 研究结果 研究通过 scRNA-seq 获得了 60dpf 野生型斑马鱼 ( 包含典型 IBs 型 ) 尾部肌肉组织共 13075 个细胞，鉴定 了 18 个细胞群（图 A）。研究者使用 monocle2 对肌腱祖细胞、成熟肌腱细胞、分化肌腱细胞和成骨细胞进行了 拟时序分析，研究 IBs 相关成骨细胞的起源，富集分析显示多个成骨细胞簇基因 (id2a、thbs1b、nog3、nog2、 tgfb3) 在 TGF-β/BMP 信号通路中富集。对不同分化轨迹的表达模式的分析确定了 10 个参与 IBs形成的关键候选基 因 (runx2a, runx2b, sost, bmp2a, scpp1, spp1, entpd5a, entpd5b, sox11b 和 ccn4b) （图 B）。为了进一步确 定调控 IBs 形成的关键基因，利用CRISPR-Cas9 发现，runx2b-/- 突变体的 runx2b 蛋白和 IBs 表型与野生型有 显著差异。显微 CT 扫描和骨组织染色也显示突变体中 IBs 完全消失（图 C）。随后，对 60dpf 的 runx2b+/+ 和 runx2b-/- 斑马鱼的 IBs 组织进行了 scRNA-seq，发现突变体中，成骨细胞几乎消失，肌腱细胞亚群与总细胞数相比的百分比也出现了不同程度的下降。且 runx2b+/+ 和 runx2b-/- 成骨细胞簇之间的差异表达基因TGF-β/BMP 通路中显著富集（图 D）。进一步阐明了 runx2b 对成骨细胞分化和 IBs 形成的促进作用。 图：斑马鱼肌肉组织细胞图谱及拟时轨迹分析 原文索引 Nie CH, Wan SM, Chen YL, et al. Single-cell transcriptomes and runx2b-/- mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish. Natl Sci Rev. 2022;9(11):nwac152. Published 2022 Aug 2. doi:10.1093/nsr/nwac152 二、单细胞转录组测序揭示成年斑马鱼不同器官中巨噬细胞和树突状细胞的异质性 发表期刊：Cell Reports 影响因子：8.8 发表时间：2023.07 研究背景 组织驻留巨噬细胞 (TRM) 和树突状细胞 (DC) 是天然免疫系统的重要组成部分，在免疫、组织发育、组织动态平衡和组织修复等方面发挥着关键作用。此外，巨噬细胞和树突状细胞在组成上也呈现出高度异质性。近年来，随着单细胞组学技术的发展，各种组织和器官中均被鉴定出了不同类型的巨噬细胞和树突状细胞亚群。然而，目前对于这些不同组织和器官中的亚群细胞在发育和功能上的关系仍然知之甚少。由于其保守的造血系统以及各种遗传工具和命运图谱策略的可利用性，斑马鱼成为研究造血细胞（包括 TRM 和 DC）发育的最佳模型系统。尽管斑马鱼巨噬细胞已经被广泛地研究了各种报告系和缺陷系，然而，斑马鱼的 TRM 异质性和 DC 细胞的生物学特性在很大程度上仍不清楚。 研究材料 本研究利用标记泛髓系细胞的转基因斑马鱼品系 Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通过流式细胞分选富集了 6 个不同器官中的 mpeg1.1+ 细胞进行了单细胞转录组测序。 研究思路 研究结果 本研究利用标记泛髓系细胞的转基因斑马鱼品系 Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通过流式细胞分选富集了 6 个不同器官（3 个屏障组织（表皮、鳃、肠）和 3 个内脏器官（肝、心脏和脑））中的 mpeg1.1+ 细胞进行了单细胞转录组测序。分别对源于表皮：2,832 鳃：3,711，肠：3,286；肝：3,248；心脏：3,679 脑：2,842 个高质量单细胞进行聚类分析，共注释出 8 个细胞亚型（图 A），mpeg1.1+ 免疫细胞群在各个器官中高度保守，且所有器官中的巨噬细胞和D细胞显示出保守的谱系特异性转录因子 (TF) 的表达（图 B）。进一步细化聚类分析发现，外周器官中的巨噬细胞主要可以分成两类亚群，一类是高表达吞噬和炎症相关基因的促炎巨噬细胞（pro-inflammatory macrophages），另一类则是高表达组织重塑及再生修复相关基因的组织重塑巨噬细胞（pro-remodeling macrophages）（图 C）, 此外，斑马鱼各组织器官中的树突状细胞组成与哺乳动物相似，既包括高表达 MHCII 相关基因，负责抗原呈递的传统树突状细胞（cDCs），也包括专门感知和应对病毒感染的浆细胞样树突状细胞（pDCs）（图 D）。在成年斑马鱼大脑中发现存在吞噬小胶质细胞和调节性 DCs，并在中枢神经系统中发挥特殊功能（图 E）。 图：斑马鱼髓系细胞图谱以及跨器官分析 原文索引 Zhou Q, Zhao C, Yang Z, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793 三、单细胞核转录组联合单细胞 ATAC 测序构建文昌鱼胚胎的细胞分化谱系 发表期刊：Cell Reports 影响因子：8.8 发表时间：2022.06 研究背景 受精卵从单细胞起始，如何分化发育为不同类型的细胞、组织和器官，最终形成一个完整的生命体，是发育生物学研究的基本问题和长期以来的研究目标。几个世纪以来，脊椎动物的起源一直是进化和发育生物学领域的中心话题。文昌鱼是一种进化速度非常缓慢的物种，介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡型动物，是研究脊椎动物起源和演化的最佳模型，在探索脊索动物细胞命运决定保守机制和进化发育上有着极其重要的地位。 研究材料 本研究取囊胚晚期到早期幼体共 9 个发育时期（B、G3、G4、G5、G6、N0、N1、N3 和 L0）的文昌鱼胚胎进行单细胞核转录组测序；取囊胚晚期到幼虫共 6 个发育时期（B、G3、G6、N1、N3 和 L0）的样本进行单细胞 ATAC 测序。 研究思路 研究结果 本研究对不同发育时期的文昌鱼胚胎进行了单细胞核转录组测序，共获得 148,875 个单细胞，根据谱系特异性 marker 基因的表达，注释出 6 种谱系细胞类型（图 A）。对从囊胚晚期到幼体时期的样本进行了单细胞 ATAC 测序，获得约 37000 个单细胞，利用 cicreo 将 snRNA-seq 和 scATAC-seq 细胞数据整合，发现同一种类型的细胞聚集在一起，证实了 cicreo 程序的可靠性（图 B）。本研究将同一谱系细胞类型在原肠期和神经期的差异表达基因与差异peak 相关基因的交集作为谱系特异性基因，原位杂交实验验证了多个组织特异表达的新标记基因（图 C）。通过文昌鱼和斑马鱼跨物种分析表明，每个谱系都出现了同质的细胞类型，构建了文昌鱼胚胎各谱系分化过程中保守的基因调控网络（图 D）。 图：文昌鱼胚胎细胞图谱以及跨物种分析 原文索引 Ma P, Liu X, Xu Z, et al. Joint profiling of gene expression and chromatin accessibility during amphioxus development at single-cell resolution. Cell Rep. 2022;39(12):110979. doi:10.1016/j.celrep.2022.110979 四、单细胞转录组测序揭示了虾腮细胞对高 PH 胁迫的敏感和特异性反应 发表期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology 影响因子：5.5 发表时间：2022.11 研究背景 PH 是影响水生甲壳类生物生存的重要环境因素，大多数水生动物适宜的 pH 值为 7.8-8.5，一旦超过 9.0，就会出现应激反应。碱性水环境可能会直接损害虾鳃，使其失去离子转运能力，进而影响呼吸。此外，高pH可在生理状态、生化水平和代谢途径上触发对虾的许多应激反应，致其高死亡率、氧化应激、免疫抑制和病原体易感性。虽然高 pH 对虾的有害影响已经得到阐述，但高 pH 胁迫的细胞和分子机制尚未在虾中阐明。 研究材料 本研究选取两组虾腮组织（处理组和对照组，其中处理组是高 PH 处理）进行单细胞转录组测序。 研究思路 研究结果 本研究对处理组（高 PH）和对照组的虾腮组织进行了单细胞转录组测序，共获得 8115 个单细胞，聚成 0-7 个cluster，根据经典 marker 基因的表达，鉴定出三种主要的鳃细胞类型，包括柱状细胞、血细胞和间隔细胞（图A）。组间差异及基因表达分析发现柱状细胞为响应高 pH 胁迫的靶细胞类型，下调氨排泄和 H+ 运输相关基因，上调免疫相关基因。同时，RT-qPCR 验证在高 pH 胁迫下，鳃中一些离子转运相关基因的表达水平较高。值得注意的是，高 pH 值导致柱状细胞中出现了新的免疫细胞亚群，具有免疫激活和应激防御状态（图 B）。拟时轨迹分析表明，在高 pH 胁迫下，柱状细胞可以转变为功能抑制的离子细胞亚群和功能激活的免疫细胞亚群（图 C）。此外，WGCNA 分析预测了柱状细胞群的调控网络，并鉴定了两种转录因子（图 D）。综上，这些结果为单细胞分辨率下高 pH 应激反应的虾鳃细胞类型特异性机制提供了关键见解。 图：虾腮细胞图谱、拟时序以及 WGCNA 分析 原文索引 Ge Q, Wang J, Li J, Li J. Highly sensitive and specific responses of shrimp gill cells to high pH stress based on single cell RNA-seq analysis. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1031828. Published 2022 Nov 8.
