2024-04-27
相较于传统bulk测序，单细胞测序最重要的功能就是能在单个细胞水平上分析异质性，对于经常发现基因组变异（如突变、相位变异、基因缺失、基因复制和水平基因转移）的抗菌素耐药性、宿主定植及发病机制中，单细胞基因组异质性分析起关键性作用。同时，在单细胞水平上研究微生物，不仅可以检测不可培养的微生物，而且可以更多的检测到罕见变异，可以更深入了解它们在复杂的多物种群落中自然存在的个体功能。
目前，使用微生物进行单细胞测序也存在一定挑战，首先是微生物本身mRNA丰度低、转录本不稳定、体积小、胞膜和细胞壁裂解条件特异性强，导致单细胞测序方法需要复杂的工作流程。其次是液滴微流控技术，目前商业化的微流控技术不仅价格昂贵而且需要专业知识，存在一定局限性，因此需要一种易于获取和可推广的工具来分析微生物群体内的遗传异质性。
2024年1月7日来自威斯康星大学麦迪逊分校的Freeman Lan 研究团队在Nature Methods期刊上发表了一篇Massively parallel single-cell sequencing of diverse microbial populations的研究文章，文中介绍了一种用于定量的微生物单细胞靶向遗传分析——液滴的扩增子靶向测序（droplet targeted amplicon sequencing，DoTA-seq）。DoTA-seq利用水凝胶，使用简单的液滴制造器分离和裂解单个微生物细胞。接下来，一步靶向多重PCR反应同时扩增目标DNA并将独特的DNA Barcode附着在每个细胞上，最终生成用于测序的单细胞基因组文库。与之前发表的单细胞非靶向测序的液滴测序工作流程相比，DoTA-seq的靶向性使得感兴趣的基因座的捕获率很高，适用于已知感兴趣基因座的单细胞测序分析，是一种在单细胞分辨率下研究微生物基因组的强大且可推广的方法。
接下来，带大家解析这篇文章：
技术原理 图1 DoTA-seq工作流程的概述 在DoTA-seq中，作者通过微流体液滴制造器将单个细菌细胞封装到含有丙烯酰胺和可逆交联剂的液滴凝胶中（图1a），交联聚丙烯酰胺不仅耐热，而且聚丙烯酰胺凝胶基质包含10-100nm的孔隙，可以使清洗剂和酶扩散通过，裂解细胞并去除细胞质，同时包裹基因组和质粒DNA（图1b），在极限稀释下，根据泊松分布，大约十分之一的液滴凝胶将包含一个细胞，液滴制造器可以在几分钟内封装数十万个单个细胞。液滴凝胶内的细胞裂解后，作者使用第二个液滴制造器将液滴凝胶与PCR试剂和随机合成的DNA Barcode寡核苷酸一起重新封装，形成一个更大的液滴（图1c）。在含有裂解细胞和Barcode的液滴中，通过两轮PCR，将P7 Adaptor与带有Barcode序列的overlap引物连接，进行重叠延伸PCR扩增唯一Barcode和目标位点，同时连接P5 Adaptor，最终形成用于Illumina平台的扩增子测序文库（图1d）。在没有裂解细胞或Barcode的液滴中，完整的扩增子不会形成，因此无法测序。在数据分析中，Barcode序列标记了来自同一液滴的扩增子，从而标记了同一细胞。 为了证明DoTA-seq的广泛应用，作者利用DoTA-seq进行多种不同类型微生物种群的单细胞测序分析： 1、DoTA-seq可以可靠地对各种细菌混合物进行测序 图2 通过16s rRNA测序分类的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中检测到给定基因的细胞比例 利用16S rRNA基因的序列对每个细胞的种类进行分类。在约90%的测序细胞中观察到预期的基因，表明DoTA-seq可以有效地捕获单个细胞内的靶基因（图2）。发现在约0.2%的细胞中检测到假阳性，原因可能是质粒长度比基因组DNA小几个数量级，在洗涤、裂解和储存过程中，质粒有更高的机会从其同源水凝胶中扩散到邻近的凝胶中。因此，小质粒上的基因座比染色体上的基因座有更高的假阳性率。 图3 模拟菌群相对丰度 为了研究DoTA-seq对混合菌落的准确性，作者按照特定比例模拟了一个微生物群落，并且加入了一株携带RFP基因质粒的E.coil（~ 1%）和另一株不携带该质粒的E.coil（~ 99%），以评估DoTA-seq检测单个物种遗传差异的能力。结果发现在每个物种的约70-90%的细胞中检测到目标必需基因，造成这种差异的原因可能是某些基因比其他基因更有效地被捕获。引物扩增效率的差异可能导致这种差异。为了减轻这种影响，可以增加引物浓度或设计替代引物以提高效率。 综上所述，DoTA-seq可以在多物种微生物群落的单细胞水平上分析不同的细菌。 2、DoTA-seq揭示了复杂微生物群落中的基因动态 图4 DoTA-seq能够在复杂的人类肠道微生物群落中跟踪基因-物种动态 为了证明可以通过DoTA-seq来跟踪复杂微生物群落中的抗生素抗性基因（ARGs），作者生成了一个由25个不同且普遍存在的人类肠道微生物群组成的合成微生物群落，并在公开基因组中鉴定了12个ARGs，设计了DoTA-seq，结果发现了该物种基因组序列中未发现但利用DoTA-seq观察到的ARG（图4a，绿框标出），同时发现增加测序细胞的总数可以减少在DoTA-seq中观察到的技术变异性（图4b）。针对前一个问题，作者提出假设：在引物捕获效率在不同处理中恒定的前提下，基因流行率可能会随着抗生素压力的变化而变化。作者设计了实验进行验证（图4c），结果表明大多数物种的生长在抗生素的存在下受到抑制（图4d），在生长的物种中，几种ARG的流行率在不同的抗生素浓度下差异很大，而流行率的变化反映了含有该基因的细胞比例的变化（图4e）。 综上所述，在单个菌落生长过程中，多个物种建立了种群异质性，并且携带给定基因的种群部分可能会因抗生素胁迫而发生变化。 3、DoTA-seq揭示了自然微生物群中的基因-分类群关系 图5 DoTA-seq阐明了粪便微生物群落中ARG和质粒分类群的关联 为了评估DoTA-seq对天然微生物样本的能力，作者使用DoTA-seq分析小鼠和人类肠道微生物组样本。由于微流体液滴制造的限制，先从上清液中的细胞悬浮液中分离出大碎片后进行DoTA-seq（图5a），为了识别群落中的DoTA-seq靶标，先进行宏基因组测序再从中搜索ARGs和质粒复制子。在小鼠粪便样本中，通过16S rRNA基因测序鉴定的丰富分类群在DoTA-seq结果中也很丰富（图5b），DoTA-seq对具有特定分类特性的单细胞进行计数，而基于传统16S rRNA的相对丰度可能受到16S rRNA拷贝数的影响。DoTA-seq的主要应用不是确定分类的相对丰度，而是将感兴趣的基因与单细胞的分类身份联系起来。作者分别分析小鼠和人粪便样本中ARG分类群和质粒分类群的关联，揭示了ARG和质粒宿主范围存在差异（图5c，d）。 综上所述，DoTA-seq可以在复杂的天然微生物组中追踪不同感兴趣基因的分类关联。 4、DoTA-seq能够量化通过基因序列变异产生的细菌亚群 图6 DoTA-seq揭示了脆弱芽孢杆菌通过启动子反转产生的不同遗传亚群 为了验证DoTA-seq可以用于分析单细胞基因组中的基因重排或突变，作者选择脆弱芽孢杆菌荚膜多糖合成(CPS)操纵子进行测试验证，CPS操纵子的启动子受内源性重组酶（mpi）调控，mpi反转每个操纵子的启动子序列，使启动子在ON和OFF状态之间切换。使用启动子区域的DoTA-seq扩增子序列来推断每个细胞的组合启动子ON/OFF状态（图6a，b）。结果表明存在广泛的种群异质性（图6c，d），DoTA-seq可用于确定单细胞内靶基因的存在/缺失和核苷酸序列，具有广泛的潜在应用前景。
结 论 综上所述，DoTA-seq是一个可访问和通用的平台，用于微生物的超高通量单细胞遗传分析，但DoTA-seq的潜在应用范围远不止于此，通过不同实验目标调整工作流程，可以应用于除DNA测序以外单细胞测序，例如通过DoTA-seq对预先标记有DNA Barcode偶联抗体的细胞进行单细胞表型分析，如蛋白质表达或细胞表面标记，同时理论上，DoTA-seq中的两个液滴生成步骤都可以用无微流体的液滴生成方法来代替。因此，作者预计该工作流的未来版本根本不需要微流体，这将大大提高DoTA-seq的吞吐量和并行性。
