2024-04-30
春季是许多生物生长、发育、繁殖的关键时期，也是生态系统物质循环、能量流动最为活跃的阶段。科研人员在田间地头、森林湿地、湖泊河流等地辛勤采样的身影不仅是科研活动的一部分，更是人类深入观察、理解、尊重自然的过程，通过科学手段揭示自然奥秘，为生物多样性保护、生态环境修复、可持续发展等提供理论依据。
随着科学技术的发展，多组学研究已成为揭示生物复杂性、解析生命现象的重要手段。繁忙的春季采样完成后通过高通量测序、质谱检测、生物信息学分析等助力科研人员从基因、转录、蛋白、代谢、微生物等多个层面全面解析生物样本，从而揭示春季生物响应环境变化的深层次机制。
多组学春季采样指南主要涉及对不同生物样本（如植物、环境等）进行系统、科学的采集，以获取全面、高质量的数据用于后续的多组学研究。接下来，让小派带各位老师翻开春季采样指南的全新一页：
图1 春季田间采样
一、前期准备
（1）明确研究目标：确定研究主题，明确需要采集的样本类型、数量、时间点及具体分析的组学层面。
（2）设计采样方案：根据研究目标，制定详细的采样计划，包括采样地点、时间、方法、频率以及样本保存和运输条件等。
（3）准备采样工具与耗材：依据采样对象和方法，准备相应的采样器具（如采样铲、剪刀、镊子、吸管、采样瓶等）、标签、记录表、保温箱、冰盒、液氮罐以及个人防护装备。
（4）培训采样人员：确保所有参与采样的人员熟悉采样流程、操作规范、安全措施以及样本处理注意事项。
二、实地采样
（1）时间选择：春季采样应关注物候变化，如植物萌芽、开花、新叶生长等关键时期，确保样本能反映季节特性。同时，尽量选择天气晴朗、无风的早晨或傍晚进行采样，以减少环境因素对样本的影响。
（2）地点定位与记录：使用GPS或其他地理信息系统精确记录每个采样点的经纬度、海拔、地形地貌、植被类型、土壤类型等信息，拍摄现场照片作为辅助记录。
三、样本采集原则
（1）一致性与代表性
相同处理条件的样本需保证取样部位、时间点等方面保持一致；收集的样本要有代表性，可以确保实验结果的准确性和可信度。
（2）快速收集
样本需要在采集、制备、储存、运输中尽量做到迅速和及时性，尽可能缩短样本采集到实验的周期，从而保证样本的质量和稳定性。
（3）低温保存
采集样本离体后，如有分离步骤需要在4℃条件或冰上等低温环境下进行，分离好的样本立即置于液氮、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前处于-80℃以下。
四、样本运输与储存
（1）样本标记：标识一：采用油性笔在每个样本管壁及管盖上简明的标记样本名称，并用封口膜封口样本管。标识二：采用标签纸标明样本信息，贴在管壁并用透明胶带缠绕一圈。样本标记清晰明确，与样本信息单中保持一致。样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖，其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。
（2）包装与运输：将处理后的样本及时放入冰盒、液氮罐或保温箱内，保持适宜的温度（如4℃、-20℃或液氮）。样品运输过程中使用足量干冰寄送，保证样品到达收样室时保持低温状态，并使用较厚实的泡沫箱，外面使用纸箱或其他包裹一层，以免运输中泡沫箱损坏，样品遗失。
（3）长期储存：遵循各组学研究对样本储存的要求，常规组织、环境或核酸样本需-80℃冰箱保存。
五、样本采集指南（仅供参考）
5.1植物样本
采集不同组织类型（根、茎、叶、花、果实、种子等），注意取样部位的代表性。对于同一种植物，可按个体、群落或生态系统进行多层次采样。
转录组测序：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，随后取样，迅速放入预冷好的已写好编号的 RNase-free 的螺纹冻存管中，或用标记好名称（名称朝外）的锡箔纸包裹好（禁止使用自封袋、一次性PE手套包装样品），液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，在RNA提取前避免反复冻融，干冰运输。
微生物组测序：选择合适的组织部位，对组织离体前或离体后用无菌水，以去除表面的灰尘以及泥土；利用现配的75%乙醇溶液进行擦拭 3-5 次；将材料平整的放置于无菌的纱布或锡箔纸中进行折叠包埋后，立即使用液氮速冻，转移至无菌的塑料袋或 50ml 离心管中，转移至-80℃低温保存，干冰运输。
基因组测序：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，保留完整叶柄，每份样本 2×2cm左右，每个样品 2-3 份（其它部位应适当增加取样量）。装入 2 mL 离心管或螺纹管中，液氮速冻 15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
蛋白组检测：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，随后取样，根据研究的具体部位严格分离，用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。请勿寄送含有明显杂质的样本（如样本附带有泥土、沙子等），以避免二次处理带来的影响，保障提取蛋白的质量。
代谢组检测：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，随后取样，根据研究的具体部位严格分离，用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
图2 植株生长阶段
5.2微生物样本
转录组测序：取 1ml 对数期（OD600=0.5-0.8）的菌悬液于 1.5ml 无酶管中，4℃，10000rpm，2min，充分去除上清；重复几次离心（最多 3 次）或分多管离心收集，请务必收集对数期菌体，并尽可能的吸净培养基，菌体过老或培养基残留会严重影响后续的提取结果和测序质量。将菌体迅速置于液氮中冷冻 15 min，冷冻完成后-80℃保存，干冰运输。（勿使用 PBS 清洗）。
微生物组测序：取对数期（OD600=0.4-0.8）的细菌悬液于2ml 无酶管中，在4℃条件下，转速低于 10000g/min，离心时间低于10min；菌体不能有培养基残留，离心后倒干净培养基；加入适量 1x PBS 缓冲液，上下轻柔颠倒使菌体散开（勿剧烈震荡），离心收集菌体，转速低于 10000rpm/min，离心时间低于 10min。依培养基成分，重复清洗 1-2 次直至上清澄清透明；吸弃上清，不能有任何液体残留。菌体大概每管达到 2.0 EP管 0.5ml 的位置 (即 0.5g)，将菌体用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
基因组测序：取对数期（OD600=0.4-0.8）的细菌悬液于2ml 无酶管中，在4℃条件下，转速低于 10000g/min，离心时间低于10min；菌体不能有培养基残留，离心后倒干净培养基；加入适量 1x PBS 缓冲液，上下轻柔颠倒使菌体散开（勿剧烈震荡），离心收集菌体，转速低于 10000rpm/min，离心时间低于 10min。依培养基成分，重复清洗 1-2 次直至上清澄清透明；吸弃上清，不能有任何液体残留。菌体大概每管达到 2.0 EP管 0.5ml 的位置 (即 0.5g)，将菌体用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
蛋白组检测：采用离心法收集菌体(保证离心后菌体的体积一致)，预冷的PBS 洗涤2-3次，每次清洗后 4℃，5000 rpm 离心 5min 将上清完全弃去，菌体收集在 2 mL 进口离心管（冻存管）中，将菌体用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
代谢组检测：采用离心法收集菌体(保证离心后菌体的体积一致)，用预冷的 PBS 快速冲洗 2-3 次，每次清洗后 4℃，5000 rpm，离心5 min；将上清完全弃去，菌体收集在 2 mL 进口离心管（冻存管）中，将菌体用液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
图3 微生物培养
5.3土壤样本
按照深度分层（如0-10cm、10-20cm等）采集，每层取混合样。记录土壤湿度、颜色、质地等信息。使用无菌工具避免污染，尽快冷藏或冷冻保存。
微生物组测序：使用消毒过的合适长度的不锈钢 T 型土壤采集，自上而下打出孔径 5cm 的土壤柱，选择合适的土层，利用无菌刮勺采集适量样本至 2ml 或 5ml 无菌离心管中（体积不超过容器的 2/3），将离心管放置在装有冰袋的保温盒中，采集结束后立即转移至实验室，-80℃保存，干冰或冰袋运输。如果样本珍贵，需要进行备份。
蛋白组检测(宏)：挖取地下 5~20cm 的土层，去除可见杂质后，土壤过 2mm 筛网， 用灭菌的 2.0ml 离心管，每份 10g，并做好标记，-80℃冰箱低温保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，干冰运输。
代谢组检测：将收集到的土壤样本用离心管收集，冷冻干燥；将土壤进行过筛处理：使用 2 mm 土壤筛以中速振动 2 min，并用容器收集；将收集到的样本每 1000 mg 放入进口离心管（冻存管）中 ，液氮速冻15 min，转移到-80℃低温保存，干冰运输。
图4 土壤采集
5.4水体样本
采集不同深度、不同区域的水样，记录水温、pH、溶解氧、电导率等参数。使用无菌采水器，并尽快过滤、冷藏或冷冻保存。
微生物组测序：以水体-滤膜为例：利用合适的无菌容器采集足量的水样（采集前利用备采集水样润洗 3 次以上），将采集的水样放置于含有冰块或冰袋的保温箱中，及时带回实验室；选择合适的孔径的滤膜在真空过滤装置上进行过滤 1~2 张（滤膜直径≤5cm）；转移滤膜至无菌的 50ml 离心管中，置于-20℃进行保存。
蛋白组检测(宏)：水样沉淀污泥等大颗粒杂质后，需要通过相应孔径的滤膜进行过滤，过滤后微生物会截留在滤膜上，将滤膜置于离心管中，并做好标记，-80℃冰箱低温保存。由于材质问题，冷冻后的滤膜较脆易碎，建议冷冻时间不要太久，尽快送样。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，干冰运输。
代谢组检测：收集水体样本，离心取上清；由于上清液中代谢物浓度较低，建议进一步浓缩或冻干后，置于-80℃冰箱中保存，干冰运输。
图5 水体采集
5.5发酵物样本
微生物组测序：总量大于 5-10g ，用灭菌的 15ml 或 50ml 离心管分装，如不能及时送样请 -20℃冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 1-2 管备份，寄送样本时优先选择干冰寄送，可以考虑使用足量冷冻冰袋运输。
蛋白组检测(宏)：总量大于20g，用灭菌的 5 ml 离心管分装，并做好标记，-80℃冰箱低温保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，干冰运输。
代谢组检测：总量大于5g，用灭菌的 5 ml 离心管分装，并做好标记，-80℃冰箱低温保存，干冰运输。
图6 发酵物采集
5.6现场处理
现场处理：样本采集后立即进行初步处理，如植物样本去除杂质、土壤样本过筛、水体样本过滤等。填写样本标签，注明样本编号、采集时间、地点、采样人等信息。
六、不要失去田野工作的乐趣
春天的故事，由无数个瞬间编织而成—科研人员的足迹遍布山川湖海，记录着春天的每一次呼吸，每一抹色彩。每一次采样不仅是对大自然细微变化的敏锐捕捉，更是对生命奥秘不懈探求的坚实步伐。我们以科学之名，走进这片蓬勃的绿意，每一滴收集的露水、每一片采下的嫩叶、每一抔筛选的土壤，都承载着生命的律动和研究的希望。
春季采样，不仅是科学探索的旅程，也是一次心灵的洗礼，是对生命无限可能的深刻致敬。春天已经启程，探索永不止步。在这场与时间赛跑的科研征途中，小派希望老师们采集每一份样本都能成为连接现在与未来的桥梁，带领我们走向更加璀璨的科学明天！！！
