2024-06-06
引言 机制研究难？机制研究无从下手？机制研究后续如何开展？本篇文章将带大家走入微生物的世界，一起来看看蛋白质组学如何发光发热拯救微生物机制研究吧！
前情提要 微生物存在于世界每个角落，具有分布广、种类多的特性。对于微生物的研究目前大多通过宏基因组和代谢组学联合去解析微生物的群落分布、功能情况。蛋白质组学的发展为微生物的机制研究提供了另外的参考角度。针对特定微生物进行蛋白质组学机制研究在深化生命科学研究、促进医疗健康、推动药物研发、保护环境和提升农业科技等多个领域都具有重要意义。通过蛋白质组学联合其他分子生物学实验手段，我们可以更深入地了解某些特定微生物的生理功能和代谢途径，为相关领域的研究和实际生产应用提供有力支持。 图1微生物蛋白质组学研究整体思路图 微生物蛋白质组学机制研究思路整体可以清晰地分为以下几个步骤： 1、确定研究目标与对象：明确需要要解决的生物学问题，例如微生物的致病机制、适应机制、毒力因子等。 2、选择合适的样本类型和技术手段：表征不同变量条件下表型和生理指标的变化，并以单一蛋白质学或者多组学实验为出发点对样本中的基因或者蛋白质进行定性定量检测。 3、根据研究目的对蛋白质组学结果进生信分析和筛选，选定相关的特征分子，并进行PRM靶向靶向定量蛋白质组学验证。 4、利用酵母双杂交或免疫共沉淀对特征分子进行互作蛋白确认，并结合蛋白质组学探究其影响的上下游蛋白和通路。构建敲除或过表达的突变体等分子生物学实验对特征分子进行功能探索和验证。
案例分享 在今天的分享环节，将向大家展示如何利用蛋白质组学技术深入探究特定微生物的机制，并介绍其在植物学、医学以及工业和食品等多个领域所取得的高水平研究成果。
文章一、植物领域 稻瘟病菌发育过程机制探索 标题：The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus 发表时间：2024年5月9日 发表期刊：cell（IF:64） 发表单位：英国塞恩斯伯里实验室 主要技术手段：磷酸化修饰蛋白质组学、PRM靶向定量蛋白质组学、酵母双杂交、免疫共沉淀 研究背景： 水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae通常会发育出一个黑色素沉着的附着胞，使病原体能够穿透植物叶片表皮，引起病害，对全球粮食种植产业构成了巨大威胁。以往研究表明附着胞形态发生需要一个MAPK信号通路，其中病原性丝裂原活化蛋白激酶1（Pmk1）MAPK是核心组成部分。然而，这些下游Pmk1信号组分如何调节稻瘟病感染的分子机制仍然未知。 研究思路 （1）观察野生型和Pmk1突变型稻瘟病菌附着孢子随定植时间增加的表型和指标变化； （2）LFQ磷酸化蛋白质组学探究突变菌和野生菌随定植时间变化的蛋白情况； （3）不同真菌磷酸化保守程度研究； （4）PRM靶向定量蛋白质组学验证Pmk1下游靶标； （5）酵母双杂交和免疫共沉淀锁定核心分子Vts1； （6）构建位点突变和质谱靶向验证Pmk1影响Vts1生物功能和位点； 图2 稻瘟病菌发育过程机制思路图 结果速览：研究人员以稻瘟病菌分生孢子为研究对象，基于LFQ磷酸化蛋白质组学（LC-MS/MS）分析了稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）感染相关的发展情况，探索了定植过程附着孢Pmk1依赖的分子机制，结果显示在疏水表面发芽后发现了2062个真菌蛋白上的8005个磷酸位点，揭示了附着胞发育过程中磷酸化信号级联的重大重塑。比较了41种不同致病机理的真菌病原的保守性磷酸化位点图谱。然后，使用平行反应监测（PRM）来鉴真菌感染植物Pmk1 MAPK调节的磷蛋白，并通过体内外实验鉴定并验证了Pmk1的关键靶标Vts1及其作用机制。 图3 稻瘟病菌致病机制部分结果图
文章二、医学领域 益生菌宿主互作调节肠道健康机制探索 标题：The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation 发表时间：2024年4月6日 发表期刊：Nature Communications（IF:16.6） 发表单位：韩国生物科学与生物技术研究所 主要技术手段：分泌蛋白组、免疫组化、qRT-PCR、免疫共沉淀 研究背景： Akkermansia muciniphila是肠道微生物群中最丰富的成员之一，越来越多的证据支持其对维持肠道健康和改善炎症以及改善肥胖、葡萄糖稳态和相关并发症的有益作用。其衍生的生物活性分子具有靶向信号通路的潜在能力。因此，需要进一步的研究来了解宿主和A. muciniphila之间的相互作用。 研究思路： （1）分泌蛋白组发现Amuc_1409是A. muciniphila分泌中最常见的蛋白； （2）Amuc_1409通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进ISC介导的肠类器官上皮发育； （3）Amuc_1409通过促进ISC介导的再生来保护辐照或5-FU诱导的肠道损伤； （4）Amuc_1409恢复老化过程中ISCs的数量和功能； （5）Amuc_1409通过与E-cadherin相互作用促进E-cadherin/β-catenin复合物解离，从而激活Wnt/β-catenin信号通路； （6） Amuc_1409以E-cadherin依赖的方式直接促进ISCs的再生功能； 研究思路图 图4菌株关键因子调节肠道健康思路图 结果速览：此研究旨在鉴定嗜粘液芽孢杆菌中新的益生菌相关效应分子，并确定其功能。首先通过对不同培养条件下的上清进行分泌蛋白组质谱检测，发现假定效应因子实验发现Amuc_1409，通过体外肠道模型和动物模型探索了Amuc_1409治疗体内放射或化疗药物诱导的肠道损伤和自然衰老过程种中增加了肠道干细胞(ISC)的增殖和再生。机制上，通过体外结合实验发现Amuc_1409通过与E-cadherin相互作用促进E-cadherin/β-catenin复合物解离，从而激活Wnt/β-catenin信号通路。在肠道内稳态中起着至关重要的作用，是一种有希望改善和维持肠道健康的生物分子。 图5 菌株关键因子调节肠道健康部分结果图
文章三、工业领域 硝酸盐调节微生物表面活性素过量生产的机制 标题：Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering 发表时间：2024年2月27日 发表期刊：Bioresource Technology ( IF 11.4 ) 发表单位：天津大学 主要技术手段：蛋白质组学、代谢工程 研究背景：表面活性素是一种脂肽类生物表面活性剂，主要由芽孢杆菌合成。由于其具有降低溶液表面张力、生物可降解性和抗菌活性等优点，该化合物在农业和环境治理中具有巨大的应用潜力。近年来，有研究通过微生物发酵优化和菌株改良增加了surfactin的产量，但surfactin产量仍有较大的提升空间。从蛋白质组学出发解析特定条件的改良对产量提升机制有非常重要的意义。 研究思路： （1）探索枯草芽孢杆菌不同的发酵环境条件对surfactin生产的影响； （2）蛋白质组学分析筛查surfactin代谢相关蛋白； （3）使用P43启动子对候选靶点(narG、narH和cypC)进行过表达，产量提升，增强硝酸盐的还原代谢和脂肪酸底物的羟基化作用； （4）使用P43启动子分别过表达SecA、FtsY和FtsE，转运蛋白（SecA、FtsY和FtsE）的联合过表达大幅提高了表面活性素的产量； （5）投喂外源性饲料（膜转运体相关物质（海藻糖）、碳相关代谢物（半乳糖和丙酮酸）和脂肪酸相关代谢的特定物质（醋酸钠和油酸）以提高表面活性素的产量； 图6硝酸盐调节微生物surfactin产量研究思路图 结果速览：研究人员发现添加氮源（硝酸盐）提高了枯草芽孢杆菌的表面活性素的产量。通过蛋白质组学分析揭示了硝酸盐诱导表面活性素过量产生的机制，确定了与表面活性素转运和调控相关的三个关键差异蛋白（前蛋白转位酶亚基SecA、信号识别粒子受体FtsY和细胞分裂三磷酸腺苷结合蛋白FtsE）。通过组合代谢工程策略构建的工程菌株（增强硝酸盐还原、脂肪酸羟基化、合理转运体工程和喂养）与野生型菌株相比，表面活性素的产量增加了41.4倍。这项研究提供了硝酸盐诱导表面活性素过量生产的分子机制以及提高活性素产生菌株性能的策略。 图7硝酸盐调节微生物surfactin产量部分结果图
文章四、食品领域 食品添加剂抑制病原菌生长机制 标题：Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism 发表时间：2024年4月09日 发表期刊：Postharvest Biology and Technology (IF 7.0) 发表单位：北方民族大学 主要技术手段：透射电镜、蛋白质组学、转录组学、PRM靶向定量蛋白质组学 研究背景：真菌感染是水果和蔬菜收获后变质的主要原因，香芹酚（CVR）在体外具有抗真菌特性，CVR处理可以抑制细胞壁多糖的合成以及几丁质和葡聚糖的代谢，从而抑制链格孢菌的生长，已被批准为安全的食品添加剂。破坏碳水化合物的生物合成是开发新型治疗剂的一种有前途且高度特异性的方法，然而，目前尚不清楚CVR处理对链格孢菌整体碳水化合物代谢的影响机制。 研究思路： （1）电镜观察CVR降低了链格孢菌的糖原储存、几丁质分布和细胞壁厚度； （2）探究CVR对链格孢菌含糖量的影响； （3）蛋白质组学和转录组学检测和生信分析发现碳水化合物代谢在真菌细胞的生长和存活中起着至关重要的作用； （4）PRM蛋白质组学和qRT-PCR验证表达情况； （5）蛋白代谢联合分析解析CVR对菌丝体碳水化合物代谢影响的分子机制； （6）测试CVR处理降低了链格孢菌对纤维素、蔗糖、淀粉和果胶的利用能力； 图8 食品添加剂抑制病原菌生长机制思路图 结果速览：研究者发现CVR处理降低了链格孢菌的细胞壁厚度、几丁质和β-1,3-葡聚糖分布、糖原积累以及总糖、三卤糖、甘露糖、果糖和半乳糖含量。蛋白质组分析表明，CVR处理加速了链格孢菌细胞壁多糖的分解，阻碍了蔗糖的消耗，破坏了糖酵解途径，并促进了与抗逆性相关的碳水化合物的分解。此外，碳源培养的结果表明，CVR会影响碳水化合物的代谢，而碳水化合物的代谢与链格孢菌的生长、感染和抗逆性有关。 图9食品添加剂抑制病原菌生长机制部分结果图
参考文献： 1.Cruz-Mireles N, Osés-Ruiz M, Derbyshire P, et al. The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus. Cell. 2024;187(10):2557-2573.e18. doi:10.1016/j.cell.2024.04.007 2.Kang EJ, Kim JH, Kim YE, et al. The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation. Nat Commun. 2024;15(1):2983. Published 2024 Apr 6. doi:10.1038/s41467-024-47275-8 3.Xia L, Hou Z, Zhu F, Wen J. Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering. Bioresour Technol. 2024;397:130499. doi:10.1016/j.biortech.2024.130499 4.Zhao L, Wang J J, Zhang H Y, et al. Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism[J]. Postharvest Biology and Technology, 2024; 213, 112928. doi:10.1016/j.postharvbio.2024.112928.
