2024-06-11
克隆细菌群体依靠单个细胞的转录变异来产生增加适应性的特殊状态，了解所有细胞状态需要在单细胞水平上研究同基因细菌种群，因此，利用单细胞测序对微生物进行细胞间异质性研究迫在眉睫。与此同时，因为微生物本身mRNA丰度低、半衰期短导致难以从单个细胞中捕获足够量的转录本，没有poly-A尾不能通过3'端富集mRNA，细胞壁结构复杂裂解条件特异性强等问题，减缓微生物单细胞测序发展脚步。
2023年4月3日来自普林斯顿大学的Ryan McNulty研究团队在Nature Microbiology期刊上发表一篇Probe-based bacterial single-cell RNA sequencing predicts toxin regulation的研究文章，文中介绍了一种 probe-based bacterial sequencing (ProBac-seq)的单细胞测序方法，通过利用10X Genomics微流控装置将单个细菌细胞的微流体液滴封装与 DNA 探针的原位杂交相结合，以实现高灵敏度和高通量微生物单细胞测序。作者将ProBac-seq应用于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，结果发现ProBac-seq可正确识别已知的细胞状态，并揭示以前未报道的转录异质性；同时研究发现ProBac-seq应用于细菌发病机制下的产气荚膜梭菌可以通过乙酸盐调控亚群对毒素的异质性表达。总而言之，ProBac-seq是一种可用于揭示同基因微生物种群的异质性，并识别影响致病性的调控的微生物单细胞测序方法。
接下来，带大家解析这篇文章：
技术原理 为了利用现有的微流控单细胞测序平台，作者设计了一种用DNA探针标记单个转录本的方法。首先，通过生信软件或已发表的寡核苷酸阵列中确定独特的50bp mRNA 结合序列，作为单链DNA探针的靶区，探针组成包括用于后续5' PCR扩增的PCR Handle、通过序列互补与相应PCR杂交的结合区、唯一分子标识符（UMI）、3' poly-A尾。为每个基因设计了多个探针（互补于不同的区域），以提高转录捕获效率并减少因杂交不良或任何给定探针扩增不足而引起的背景噪音。选择phi29 DNA 聚合酶进行滚环扩增（RCA），该方法在产生足量单链DNA产物进行scRNA-seq的同时，不易像传统PCR那样产生复合错误。在探针制备的最后一步时，通过引物扩展将UMI和poly-A尾添加到原探针的3 '端。滚环扩增方法允许重新扩增探针组，用于无限制的后续实验，而无需重新订购探针。 探针制备完成后，将细菌固定在 1% 多聚甲醛中，并通过温和的溶菌酶处理进行透化以允许探针穿透，然后将相应的DNA探针与透化细菌孵育以杂交到固定化的mRNA，并通过洗涤去除未杂交或错误杂交的探针。选择一定量处理后细胞与PCR试剂和引物混合，利用10×Genomics微流控装置生成液滴，建库生成3' 单细胞转录组文库。 图1 ProBac-seq方法与验证 细菌scRNA-seq验证 为验证ProBac-seq能否表征细胞的转录状态，作者将晚期枯草芽孢杆菌等分为两份，分别使用SMART-seq和ProBac-seq进行处理，结果表明，50℃条件下利用杂交探针得到文库结果与SMART-seq文库结果相似（图1d）。为验证通过10×Genomics是否可以通过封装单个细菌进行单细胞转录组测序，将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌细胞进行独立固定，并用对应于其各自基因组的探针进行预处理，将制备好的样本与带有DNA引物的PCRMIX混合，上10×Genomics生成油包水后进行建库，结果表明，微流控平台可以成功地通过Barcode区分不同细菌的单个细胞（图1e），同时发现两个样本捕获探针的丰度高度相关，说明来自单细胞的信号提供了转录状态的良好表征（图1f）。 为了证明ProBac-seq对异质性研究的广泛应用，作者利用ProBac-seq对不同类型微生物种群进行单细胞测序分析： 1、ProBac-seq鉴定枯草芽孢杆菌的异质性 作者在添加苹果酸的M9基础培养基中选择指数后期的枯草芽孢杆菌进行ProBac-seq，捕获2784个细胞，分析得到由10个细胞簇组成的四种不同转录组特征（图2a、b）。与作者预期一致的是，观察到了具有遗传能力特征的细胞亚群（簇 6 和 8）。探针靶向的 50 个 comK 调控子基因中有 45 个在簇 6 和 8 中差异过表达（图2c、d）。 总而言之，利用ProBac-seq对枯草芽孢杆菌进行分析，不仅可以获得已知的细胞状态，并且能够识别以前未报道的细胞状态，揭示潜在基因组结构的特征。 图2 ProBac-seq分析揭示了枯草芽孢杆菌的不同转录状态 2、克隆大肠杆菌群体中的表达异质性 作者使用ProBac-seq来表征大肠杆菌MG1655的转录异质性，该菌在M9基础培养基中生长，并化学固定在对数中期。捕获3315 个细胞，通过聚类将细胞分为9个细胞簇（图3a、b），作者发现与枯草芽孢杆菌相似的是，某些簇可以通过DGE分配给特定的生物过程，例如簇 1 中的细胞独特地上调与细胞运动有关的基因，鞭毛关键基因（鞭毛蛋白，fliC）优先由簇1中的细胞表达（图3c）；簇 5、6 和 7 中显示出氨基甲酰磷酸酯的不同用途；簇 8 中 fimI、fimC 和 fimA 的显着上调，而fim 操纵子的下游基因编码Ⅰ型菌毛的成分，这些成分与生物膜的形成和致病性有关，并且已知是异质表达的。为了证实细胞亚群的存在，使用Remel Flagella染色剂对在相同条件下生长的细胞进行染色并观察（图3d），结果发现大约36 %的细胞具有组装的鞭毛，这一比例高于在簇1中的14.5%，导致结果差异的原因可能是一些有鞭毛的细胞可能已经退出转录状态，但仍然保留了翻译的蛋白质产物。 综上所述，作者对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的观察表明，广泛的表型异质性是细菌的一般特征，精氨酸代谢等过程通常局限于特殊细胞。此外，与毒力相关的基因分离到特定的细胞群中，表明特定的细胞类型可能与致病性有关。 图3 在基础培养基中生长的大肠杆菌的异质基因表达 3、产气荚膜梭菌毒素表达异质性 为了验证ProBac-seq能否在真正的病原体中鉴定不同细胞亚群，作者选择产气荚膜梭菌研究其毒素的产生，产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性孢子形成细菌，是人类和牲畜的重要病原体，导致坏死性肠炎的A型产气荚膜梭菌的毒力因子为NetB。通过BHI培养基中生长至指数期晚期的产气荚膜梭菌进行单细胞分析，捕获1508个细胞，通过聚类将细胞分为4个细胞簇（图4a）。虽然NetB在所有簇中都有表达，但NetB差异过表达定义了簇0（占比43%）。 产气荚膜梭菌中的另一种外毒素 pfoA 的产生已被证明受短链脂肪酸（如乙酸盐和丁酸盐）的调节，短链脂肪酸在胃肠道中含量丰富，并已被证明可以抑制 pfoA 外毒素，控制脂肪酸降解的基因在NetB过表达簇中上调，因此作者假设乙酸盐可用于降低产气荚膜梭菌的NetB 表达。为了验证假设，作者在培养产气荚膜梭菌的培养基中加入乙酸钠来扰乱产气荚膜梭菌的细胞外环境，并选择指数后期的产气荚膜梭菌进行ProBac-seq，结果发现，NetB 的表达再次集中在簇 0 中，其中与未处理的细胞相比，用乙酸盐处理的细胞表达的毒素显着减少，乙酸盐的添加显着降低了处于初级产毒状态（簇0）的细胞比例从43%降低到30%（图4c），毒素基因表达的减少与在含有乙酸盐的培养基中生长的培养物中分泌的细胞外NetB蛋白的减少一致。 综上所述，NetB由专门的细胞亚群差异表达，并且提供有利于替代细胞状态的生长条件可以降低克隆细菌群体中毒力细胞的比例。 图4 产气荚膜梭菌中的NetB毒素优先由细胞亚群表达，并可通过添加乙酸盐下调表达 结论 综上所述，ProBac-seq研究细菌群落的异质性的优势在于，它为研究数千个单细胞的全基因组表达水平提供了一种无偏倚的方法，从而可以全面分析基因-基因和细胞-细胞相关性，最大限度地捕获转录本，避免核糖体RNA干扰。在ProBac-seq中，由于同一探针的多个拷贝不能在任何给定的转录本上占据相同的位置，并且测序文库直接由杂交的DNA探针制成，而不产生cDNA，因此归一化UMI的数量与每个细胞中存在的mRNA靶标的数量直接相关。此外，针对每个转录本不同区域的多个探针的设计允许检测任何给定 mRNA 分子的更高机会，并为每个转录本提供额外的独立测定，可用于为低水平表达的基因获得足够的统计意义。但同时也存在一定局限性，例如，依赖于探针杂交，需要基因组的先验知识以及设计和订购大量探针的前期成本，同时依赖于10×平台。但尽管存在这些局限性，ProBac-seq仍具有快速、经济高效的特点，并可生成具有准确转录本定量的高分辨率数据集。
