2024-07-06
前言 5mC(5-甲基胞嘧啶)和5hmC(羟甲基胞嘧啶)是基因组DNA中最常见且在表观遗传调控中扮演重要角色的两种修饰形式。一般通过塑造染色质状态、影响转录因子结合等方式调控基因表达，引起细胞表型和功能上的变化，在细胞分化、发育及疾病发生过程中发挥重要作用。同时解析基因组DNA上5mC和5hmC的分布和动态关联是研究DNA甲基化动态变化的功能及其调控机制的关键。但是目前没有在单细胞水平上解析5mC和5hmC的实验技术。
PART01、技术路线 北京大学伊成器及康奈尔大学朱晨旭共同通讯在Nature Biotechnology上发表题为“Simultaneous single-cell analysis of 5mC and 5hmC with SIMPLE-seq”的文献，该研究提出了一种在单细胞、单分子水平上同时检测5mC和5hmC的测序技术—SIMPLE-seq。该技术使用两个正交标记步骤将靶向修饰(5mC和5hmC）转化为两种胸腺嘧啶(T)类似物，在每个标记步骤之后，利用DNA聚合酶延伸反应记录转化产物中的碱基突变信号(5mC-to-T，5hmC-to-T)。同时引入带有修饰碱基的标记序列并利用其伴随（C-to-T）产生的突变信号对5mC和5hmC的突变信息进行拆分，实现同时检测同一条DNA分子上的5mC和5hmC。为了区分来自两个标记反应的突变信号，使用具有指示序列的特殊引物：来自5hmC标记步骤的延伸产物将进行第二次5mC标记反应以产生突变的指示序列；相反源自5mC标记的产品保留了原始指示序列。除此之外，研究团队将该流程与细胞组合标签技术相结合，可实现高通量、单细胞、全基因组水平的5mC和5hmC测序，如图1所示。 图1 SIMPLE-seq实验技术原理图
PART02、性能验证 作者首先将SIMPLE-seq技术应用于研究不同干性培养条件下小鼠胚胎干细胞的表观图谱差异，在单分子水平上鉴定了5mC和5hmC的分布关系，解析了两种干细胞状态下DNA表观遗传图谱的重编程变化，如图2所示。观察到来自一致和不一致基序组的相似数量的TFs与TF基因表达水平呈正负相关，表明5mC和5hmC对TF结合和调控输出的明显而复杂的影响。除此之外发现这两组的小鼠胚胎干细胞在5hmC上比在5mC上可以更明显地相互分离，同时这种细胞间5mC和5hmC的明显异质性促使我们分析单细胞中5mC-5hmC的关系。最终揭示了与活性染色质相关的多种5hmC类型，同时也表明了SIMPLE-seq在揭示小鼠胚胎干细胞的不同状态转换过程中与不同调节功能相关的不同5hmC类型的效果。 图2 同一分子的5mC和5hmC的分析结果 除此之外，作者还将SIMPLE-seq技术应用于分析细胞组成复杂的组织样本，包括绘制了约3000个人外周血单个核细胞以及6000个小鼠大脑皮层细胞的DNA甲基化和羟甲基化图谱，如图3和图4所示。作者结合两类表观遗传修饰鉴定得到精确的细胞分型结果，探究了5mC和5hmC与转录因子结合、组蛋白修饰、基因表达等其他组学之间的关系，展示了SIMPLE-seq在多种复杂生物学样本中鉴定不同细胞类型和状态的能力，体现了DNA甲基化和羟甲基化联合分析的巨大潜力和广泛应用场景。 图3 人PBMC中细胞类型特异性的5mC和5hmC图谱 图4 小鼠脑5mC和5hmC的单细胞图谱
综上所述, SIMPLE-seq是一种在单细胞、单分子水平上同时检测基因组DNA甲基化和羟甲基化的新技术, 可以在复杂生物学样本和复杂生物学过程中检测多种细胞类型的基因组DNA表观遗传修饰的全景图谱。除此之外，可进一步与转录组、组蛋白修饰、染色质可及性或染色体构象分析相结合，以扩大综合细胞分析的范围。
