2017-04-21
说到丛枝菌根真菌的研究，派森诺生物已积累了丰富的项目经验。在众多项目合作过程中，我们发现不同的PCR扩增引物对丛枝菌根真菌群落的测序结果有很大的影响。小编今天要讲解的这篇发表在微生态学老牌期刊《Environmental Microbiology》（最新影响因子5.932）上的论文，就对丛枝菌根真菌的两对不同引物的扩增测序效果进行了全方位的比较和评估。
研究背景
真菌是土壤微生物中重要的组成部分，有些作为重要的环境物质降解代谢菌，有些则是病原体，当然也少不了植物菌根共生微生物，而其中丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）就是非常重要的一类微生物。AMF菌能与宿主植物互利共生，并为宿主提供氮、磷、硫源和水分，保护宿主免受病原体的侵害；作为回馈，宿主植物则将光合作用的产物以碳源的形式输送给AMF菌。除此之外，AMF菌的多样性是宿主植物多样性的决定性因素之一。从2001年起，分类学上已将丛枝菌根真菌归属到Glomeromycota门下，其中包含Glomeromycetes纲以及Glomerales、Diversisporales、Archaeosporales和Paraglomerales目。鉴于AMF菌对宿主植物和土壤肥力的重要作用，运用高通量测序技术对AMF菌的多样性组成谱进行研究也已越来越流行。
研究目的
本文旨在通过高通量测序的方法探究地中海生态系统中AMF菌的多样性组成，并评估不同引物对于AMF群落多样性组成谱测序结果的影响。
研究方法
测序技术：454 GS-FLX焦磷酸高通量测序平台
测序模式：AMF微生物组18S rRNA测序
实验对象：取自5个不同地点的25份土壤样本
实验设计：意大利撒丁岛（地中海区域）北边的丘陵主要富含五种土壤，分别为TV、CV、MM、PA、CO，每种土壤取5份土壤样品，分别用两对引物（AMV4.5NF/AMDGR和NS31/AMmix）进行扩增，得到50个扩增产物，对每种土壤的五份样品扩增产物进行混样，用最终得到的10个混合样本进行高通量测序。
研究结果
通过对10个土壤样本进行高通量测序，共获得10924条序列，每样本平均获得1092条高质量序列。其中引物AMV4.5NF/AMDGR扩增片段测序获得6799条序列，而引物NS31/AMmix扩增片段测序获得4125条序列。
在门水平，两对引物所获得测序数据量（绝对丰度和相对丰度）的比较。由图中数据可知，引物AMV4.5NF/AMDGR扩增片段测序结果中所包含的Glomeromycota门绝对序列量和相对丰富都显著大于引物NS31/AMmix扩增片段测序获得Glomeromycota门的数据量。
两种不同引物测序所获得的五种不同土壤样品中，含有的Glomeromycota门数据量，引物AMV4.5NF/AMDGR所获得的数据量都明显高于另一对应物，并且在PA土壤中两对引物所获得的数据量都是最多的，而在CO土壤中则是最少的。
分别在相似度为80%、85%、95%、97%的条件下，对AMF菌测序所得序列划分OTU，并绘制稀疏曲线。由图可知，97%的阈值下划分所得OTU数最多，但两对引物在相同的阈值条件下，划分所得OTU数差别很大；而通过ACE和Chao1指数预估的群落中OTU总数显著多于97%阈值下划分所得OTU数。
由OTU的丰度等级曲线可知，在97%的相似度下，序列都集中于少数高丰度OTU中。
将测序所得Glomeromycota门中4个目的测序序列数和97%阈值下划分所得OTU数进行比较分析，由饼图可知，虽然两对引物测序所得总数据量不同，但是其中所含Glomeromycota门中4个目的相对丰度是较为一致的；由OTU和数据量的绝对丰度和相对丰度柱状图可知，不同土壤样品中所含OTU数和测序序列数的分布也是一致的。
OTU维恩图分析显示，引物AMV4.5NF/AMDGR测序结果中，有11个OTU存在于五种不同土壤中，其中9个属于Glomerales目，2个属于Diversisporales目；引物NS31/AMmix测序结果中，五种土壤只共有1个OTU属于Glomerales目；对五种土壤（引物AMV4.5NF/AMDGR）测序结果进行Jaccard相似指数分析，由表可知，土壤TV和PA、TV和CV之间AMF菌群组成结构的相似性最高。
总结
本研究对意大利撒丁岛（地中海区域）北边的丘陵中主要富含的五种土壤进行高通量测序，从而研究AMF菌群的多样性组成谱。本研究的一个显著特点在于，使用了两对不同的引物对土壤样品进行扩增测序，而对两对引物的测序结果进行分析对比可知，引物AMV4.5NF/AMDGR更适用于AMF菌的高通量测序，为关注AMF菌多样性组成的众多研究人员提供了更加科学靠谱的引物选择依据！
文末福利
值得一提的是，上述文献中的两对引物的扩增片段长度都在200~300 bp之间，都可以用Illumina超高通量的测序技术进行测序分析哦！
另外，除了引物选择，AMF菌群的测序分析还有一个关键点，那就是使用MaarjAM（http://www.maarjam.botany.ut.ee/）数据库进行物种注释！派森诺生物已将MaarjAM数据库整合于AMF菌群的多样性组成谱标准分析流程，欢迎各位新老客户来尝试哦！
文章索引：
Lumini, E., Orgiazzi, A., Borriello, R., Bonfante, P. & Bianciotto, V.Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach. Environ. Microbiol.12,165–2179 (2010).
点击链接，阅读原文：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1462-2920.2009.02099.x/abstract
