2024-07-18
前言 水稻是重要的主食和模式物种，大多数关于水稻分子景观的研究都集中在RNA表达和表观遗传修饰上，早期对水稻蛋白质组的研究只针对有限的组织，且仪器分辨率较低，大多缺乏准确的蛋白质定量。2024年7月中国农业科学院生物技术所等单位在Nature Plants（IF 15.8）上发表了题为Mass spectrometry-based proteomic landscape of rice reveals a post-transcriptional regulatory role of N6-methyladenosine的研究论文，描绘了水稻全景定量蛋白质组图谱，将有助于我们对水稻生物学和水稻组织生理功能机制的认识。
研究思路
研究结果展示 一、水稻组织定量蛋白质组学景观 对14种水稻组织（种子、根、茎、叶、雌蕊、花粉等）进行TMT标记蛋白质组学分析（图1a），在所有样本中识别了15174个基因编码的蛋白质，鉴定了8964个UniProt数据库中已记录的蛋白质（图1b）。对相同的水稻样本进行了RNA测序（RNA-seq）分析，发现几乎所有蛋白质编码基因（PCGs）都有mRNA水平的证据（图1c）。在每个组织中，具有mRNA表达的基因数量约为蛋白质表达的基因数量的两倍（图1d）。值得注意的是，缺乏蛋白质证据的基因中有很大一部分表现出低水平的表达（图1e），这表明转录本丰度较高的基因更倾向于被翻译成蛋白质。 图1 定量蛋白质组学图谱 二、组织富集蛋白和组织特异性蛋白 主成分分析（PCA）显示蛋白质组学数据具有良好的可重复性（图2a）。作者计算了每个组织中的相对蛋白表达水平，发现雌蕊蛋白质组具有最丰富的组织性和组织特异性的蛋白质，其次是花粉和根尖（图2b）。对组织富集蛋白的功能富集分析揭示了与组织功能相关的关键生物学过程和途径。例如，胚胎发育相关蛋白在种子III中富集，而脂肪酸代谢过程相关蛋白在种子I中富集（图2c）。对组织蛋白质组进行了两两交叉比较，发现生理和空间相关的组织在组织特异性蛋白中表现出交叉，如三个种子样本之间、全根和根尖之间、花粉与成熟小穗之间交叉（图2d）。亚细胞定位注释分析显示了各组织蛋白定位情况（图2e），对光合组织和非光合组织进行了蛋白质组学分析，确定了672个在光合组织中高表达的核心蛋白（图2f）。 图2 跨水稻组织的定量蛋白质组学分析 三、水稻和拟南芥蛋白质组之间的保守特征 作者将5069对同源蛋白（占所有水稻拟南芥同源蛋白的56.5%）进行了关联分析来研究水稻和拟南芥蛋白质组的异同（图3a）。总体而言，相关分析和PCA分析显示在如花粉、叶片、茎和雌蕊等许多相应组织中，拟南芥和水稻之间的蛋白质组普遍保守，而在其他组织中，种间蛋白质组的保守程度较高（图3b，c）。光合组织在相关图和PCA图中聚类，突出了单子叶水稻和双子叶拟南芥之间的光合作用保护。尽管蛋白质组表达的普遍保守，但也观察到一些广泛的差异。水稻和拟南芥的种子和成熟小穗蛋白质组和转录组差异最为大（图3b）。 图3 拟南芥与水稻的蛋白质组比较分析 四、RNA与蛋白质丰度的相关性 计算组织间蛋白质-RNA相关性（图4a），12896个基因中的5867个基因的蛋白质水平与RNA水平呈显著正相关，而大量基因（6838）无显著相关，极少量基因（191）呈负相关（图4b，c）。不同组织的相关系数不同，从成熟小穗的0.19到雌蕊的0.70（图4d），说明转录后调控、转录稳定性和蛋白质合成机制可能对不同组织的蛋白质丰度有不同的影响。采用蛋白质-RNA比值（PTR）来评估蛋白质和RNA水平的变化，组织间蛋白质和RNA水平的变化与蛋白质和RNA丰度无关，这表明蛋白质和mRNA水平的组织特异性调控与它们的绝对丰度无关。然而，较高的PTR蛋白在不同组织中往往变化更大，这表明翻译调控在塑造组织特异性蛋白质组中起着重要作用（图4e）。参与植物对氧化胁迫反应和细胞壁组织的基因检测到高PTRs（图4f），这表明转录后调控有助于水稻和外刺激之间的相互作用。 图4 水稻组织中蛋白质丰度与RNA表达的相关性分析 五、跨水稻组织中m6 A修饰的图谱 转录后调控是导致蛋白质和RNA水平不一致的主要原因。最丰富的转录后修饰之一是RNA甲基化m6 A修饰，其在水稻中的分布和功能却基本未知。为了探索m6 A在转录组中的动态和分布，作者在14个组织中进行了m6 A-seq2，m6 A峰优先出现在3’非翻译区（UTR）内，且m6 A峰的分布模式在所有水稻组织中都是保守的（图5d）。水稻中保守的m6 A峰的强度显著高于非保守的m6 A峰（图5f），保守的m6 A信号富集了参与翻译调控活性和细胞定位的基因（图5g）。检测水稻中m6 A与基因表达的相关性发现m6 A与mRNA水平呈负相关。 图5 水稻组织中的m6 A甲基组 六、UTR中m6 A修饰对翻译产生负面影响 比较有m6 A和没有m6 A的基因中RNA水平与蛋白质丰度之间的相关性发现有m6 A的基因中RNA和蛋白质水平之间的相关性较弱（图6a），分析m6 A水平对mRNA-蛋白相关性的影响，发现两者呈负相关（图6b），分析了水稻组织中mRNA-蛋白的两两相关性，发现有m6 A的基因的相关系数显著低于没有m6 A的基因（图6c），这表明m6 A在决定RNA-蛋白不一致性中起着关键作用。为了确定m6 A的这种调控作用是否依赖于其在转录本中的位置，研究检测了m6 A在不同转录本区域的位置，在5’UTR和/或3’UTR中含有m6 A的基因的PTRs显著低于没有m6 A的基因（图6d），表明m6 A在水稻中具有翻译抑制作用。利用水稻原生质体系统进一步研究了m6 A的翻译抑制功能。作者合成了由35S启动子驱动和不驱动m6 A基序的荧光素酶（LUC），并将其转化到水稻原生质体中。此外研究人员还对FTO进行了共转化，它编码一种m6 A去甲基化酶（图6e）。随后，分析LUC蛋白活性和基因表达水平发现，有m6 A和没有m6 A的LUC之间的蛋白水平具有可比性（图6f）。有趣的是，含m6 A的LUC的表达量显著高于不含m6 A或与FTO共表达的LUC（图6g）。这些结果表明，LUC转录本上的m6 A抑制了mRNA的翻译，导致蛋白产量降低。 图6 m6A对水稻蛋白质丰度贡献 七、鉴定可能参与m6 A调控的潜在基因 通过对各种组织中的m6 A水平进行综合分析，发现了一些基因，它们可能是参与m6A甲基化的新调控因子，其蛋白水平与水稻各组织中m6A丰度相关。其中介导蛋白MED18与各组织的m6 A水平呈负相关（图 7a），为了验证其在m6 A甲基化中的作用，利用CRISPR-Cas9生成了水稻 medl8 突变体（图 7b），与野生型（WT）植株相比，突变株表现出相似的表型，根和芽都更短（图7c-e）。LC-MS/MS分析显示，med18突变体的m6 A水平显著高于野生型（图7f），表明med18对水稻m6 A甲基化有影响。基于medl8水稻突变体和WT植株，进行TMT标记的质谱分析研究m6 A在调节蛋白质丰度中的作用，分析了RNA表达和转录组范围的m6 A位点（图7i）。med18-1中m6 A增加或增加的基因的PTR显著降低，而med18-1中m6 A减少或缺失的基因的PTR显著增加。这些结果进一步证实了m6 A对蛋白表达的负面影响。 图7 MED18作为植物中新型m6 A调节因子的鉴定 总 结 该研究通过TMT蛋白质组学量化了14种水稻组织中超过15000个基因的相对蛋白水平。鉴定了与单个组织的功能特异性相关的组织特异性和组织富集蛋白。水稻和拟南芥的蛋白质基因组比较显示出保守的蛋白质组表达。值得注意的是，在水稻主要组织中对m6 A的分析表明，非翻译区m6 A与蛋白质丰度呈负相关，并导致RNA和蛋白质水平的不一致。此研究为水稻蛋白质基因组学的进一步研究提供了一个范例。
参考文献：Li ST, Ke Y, Zhu Y, et al. Mass spectrometry-based proteomic landscape of rice reveals a post-transcriptional regulatory role of N6-methyladenosine. Nat Plants. Published online July 12, 2024.
