2024-08-07
在探索生命奥秘的征途中，DNA作为遗传信息的载体，其完整性与准确性对于解析物种的遗传信息、进化历程、生理特性和疾病机制具有不可估量的价值。高通量测序技术，作为现代生物学的锐利工具，为我们提供了前所未有的视角，深入剖析DNA的微妙变异与复杂调控。基因组Denovo、群体进化、GWAS性状定位、WGS、WES测序等，每一项技术都是解开生命密码的关键钥匙。
然而，这一切探索的基石，在于高质量DNA样本的获取与妥善管理。样本的采集、运输与保存，每一个环节都如同精密仪器中的齿轮，紧密相连，共同确保遗传信息的完整无损。为了助力科研工作者在探索之路上行稳致远，我们精心整理了一套基因组研究样本寄送的标准化流程及注意事项，旨在为您的研究之旅保驾护航。
1、动植物样本
植物样本 | |||
测序平台 | 最少送样量 | 建议送样量 | 样本保存与运输 |
二代测序 | 嫩叶鲜重0.5g | 嫩叶鲜重1.5g | 二代和三代测序样本：建议收集于Axygen 1.5/2.0ml管中，或选用密封性更好的2.0ml螺纹冻存管；2.Hi-C和超长ONT样本：推荐使用 50ml离心管；3.全长转录组：取样后迅速放入预冷好的已写好编号的 RNase-free的螺纹冻存管中。样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存； 干冰运输。 |
三代测序(Pacbio Revio) | 嫩叶鲜重5g | 嫩叶鲜重10g | |
Hi-C测序 | 嫩叶鲜重2g (0.5g/管) | 嫩叶鲜重2g (0.5g/管) | |
超长ONT测序 | 嫩叶鲜重2g (0.5g/管) | 嫩叶鲜重2g (0.5g/管) | |
全长转录组 | 嫩茎、嫩叶鲜重 0.5g，根、花、果实、种子等 0.8-1g | 嫩茎、嫩叶鲜重 0.5g，根、花、果实、种子等 0.8-1g | |
样本准备方法 | |||
样本收集 | 二代和三代取样：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，保留完整叶柄，每份样本 0.5g(2×2cm2)左右，每个样品 2-3 份（其它部位应适当增加取样量）； Hi-C和超长ONT取样：先观察，用手触摸，选取顶部刚长出的触感柔软的小嫩叶。注意：选材时需要组织幼嫩，叶片小不等于嫩，嫩叶的触感和老叶有明显不同。 全长转录组取样：选取新鲜的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质，随后取样。 | ||
注意事项 | 1. 失绿、衰老严重、干燥样本提取成功率会很低； 2. 样本不建议使用硅胶干燥保存，会影响DNA质量； 3. 叶绿体项目，送样量请加倍。 | ||
动物样本 | |||
测序平台 | 最少送样量 | 建议送样量 | 样本保存与运输 |
二代测序 | 肌肉组织鲜重 0.3g血液样本（哺乳动物1mL；非哺乳动物0.5mL） | 肌肉组织鲜重 0.6g血液样本（哺乳动物3mL；非哺乳动物1.5mL） | 样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存；干冰运输。 |
三代测序(Pacbio Revio) | 肌肉组织鲜重 5g血液样本（哺乳动物10mL；非哺乳动物5mL） | 肌肉组织鲜重 10g血液样本（哺乳动物10mL以上；非哺乳动物5mL） | |
Hi-C测序 | 软组织（肝，脾，肾等）2g以上；纤维组织（肌肉）2~5g | 软组织（肝，脾，肾等）2g以上；纤维组织（肌肉）2~5g | |
超长ONT测序 | 软组织（肝，脾，肾等）2g以上；纤维组织（肌肉）2~5g | 软组织（肝，脾，肾等）2g以上；纤维组织（肌肉）2~5g | |
全长转录组 | 每个部位组织鲜重0.5g | 每个部位组织鲜重0.5g | |
样本准备方法 | |||
样本收集 | 肌肉组织样本：取肌肉组织（推荐），每份鲜重 0.3-0.5g(一个黄豆大小，非肌肉组织建议适当增加送样量)左右，组织离体后需快速用 PBS 冲洗掉其他多余残留组织，用吸水纸去除多余的液体，组织离体后需快速清洗，立即装入2 mL离心管； 血液样本：采集新鲜血液 2-3mL于抗凝管中（推荐使用 EDTA 抗凝管（紫色盖子采血管）），立即充分混匀样本。由于会影响提取效果，不能使用肝素抗凝（绿色、棕色盖子采血管）。 全长转录组取样：快速从动物活体取材获得 0.5g 组织后，快速用预冷的RNase free 水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除非研究组织。将采取的组织迅速放入预冷的 RNase-free 带螺旋帽的 1.5 mL 或 2.0 mL 的 EP 管/冻存管中。 | ||
注意事项 | 1.不建议使用无水乙醇、福尔马林等保存样本，会影响DNA质量； 2.Hi-C测序推荐使用组织样本，血液样本提取细胞核时未做研磨处理，可能有一部分还是细胞状态，而在酶切连接时，细胞内容物中的一些杂质影响了酶的活性，导致样本酶切连接效率较低； | ||
昆虫样本 | |||
测序平台 | 最少送样量 | 建议送样量 | 样本保存与运输 |
二代测序 | 中大型昆虫（体长 5mm，体宽 3mm 以上）0.3g；微体型昆虫（蚜虫、飞虱类等）0.3g | 中大型昆虫（体长 5mm，体宽 3mm 以上）0.9g；微体型昆虫（蚜虫、飞虱类等）0.9g; | 样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存； 干冰运输。 |
三代测序(Pacbio Revio) | 中大型昆虫（体长 5mm，体宽 3mm 以上）3g；微体型昆虫（蚜虫、飞虱类等）2g | 中大型昆虫（体长 5mm，体宽 3mm 以上）6g；微体型昆虫（蚜虫、飞虱类等）4g | |
Hi-C测序 | 送样前提前需提前沟通 | ||
超长ONT测序 | 送样前提前需提前沟通 | ||
全长转录组 | 每个部位组织鲜重0.5g | 每个部位组织鲜重0.5g | |
样本准备方法 | |||
样本收集 | 中大型昆虫：若为野生昆虫，最好活体状态下用 75%乙醇漂洗昆虫外表进行消毒杀菌处理，随后取肌肉组织或头部（避开昆虫肠道，以避免肠道微生物的污染，或整只昆虫直接放入离心管内）； 微体型昆虫：建议取活昆虫（如蚜虫，20只以上，0.2-0.5g 左右），放入 2 mL 离心管。 全长转录组取样：快速从动物活体取材获得 0.5g 组织后，快速用预冷的RNase free 水进行漂洗，以去除污物，并剔除非研究组织。将采取的组织迅速放入预冷的 RNase-free 带螺旋帽的 1.5 mL 或 2.0 mL 的 EP 管/冻存管中。 | ||
注意事项 | 1.不建议使用无水乙醇、福尔马林等保存样本，会影响DNA质量； 2.大型昆虫建议去除腹部肠道污染，微体型昆虫建议饥饿处理，排除肠道微生物污染再送样。 | ||
2、微生物样本
微生物样本实验室不接收液体样本，液体样本在处理过程中会造成气溶胶污染，导致整个实验室环境污染，进而影响所有老师项目。样本较少、菌液样本、培养基残留过多、样本水分大等情况，严重影响提取效率。液体样本、样本量不满足送样要求的，实验室会直接拒收。
细菌样本 | |||
种类 | 最少送样量 （二代/三代） | 建议送样量 （二代/三代） | 样本保存与运输 |
细菌 G- | 菌体湿重 0.1g/0.5g | 菌体湿重 0.3g/1.0g | 菌体建议收集于Axygen1.5/2.0ml管中，或选用密封性更好的2.0ml螺纹冻存管。样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存；干冰运输。 |
细菌 G+ | 菌体湿重 0.3g/0.7g | 菌体湿重 0.5g/1.4g | |
样本准备方法 | |||
样本收集 | 菌体培养：至对数期的菌体，OD600值介于0.4-0.8之间(不同菌种达到对数期时的OD值可能有差异)，如果是多糖或次生代谢物较多的菌体，OD600值介于0.4-0.6之间。 菌体收集：在 4℃条件下，转速低于 10000g/min，离心时间低于 10min；菌体不能有培养基残留，离心后倒干净培养基，如还有残留，可短暂离心后(几秒钟即可) 用移液枪吸取干净；加入适量 1x PBS 缓冲液（Ambion，货号:AM9624），上下轻柔颠倒使菌体散开（勿剧烈震荡），离心收集菌体，转速低于 10000rpm/min，离心时间低于 10min。 | ||
注意事项 | 1. 请勿用甘油菌直接复苏后摇菌收集菌体进行后续实验，请严格挑选单克隆摇菌； 2. 细菌样本建议使用液体培养基摇瓶培养； 3. 培养基需澄清透明(类似于 LB 培养基，YPD 培养基等)，不含不溶成分如：不溶淀粉、谷粉、不溶盐类、颗粒悬浮杂质等。不建议使用血培养基。 | ||
真菌样本 | |||
种类 | 最少送样量 | 建议送样量 | 样本保存与运输 |
二代测序 | 菌体湿重 0.3g | 菌体湿重 0.5g | 菌丝体建议收集于Axygen 1.5/2.0ml管中，或选用密封性更好的2.0ml螺纹冻存管。样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存； 干冰运输。 |
三代测序(Pacbio Revio) | 菌体湿重1g | 菌体湿重3g | |
Hi-C测序 | 菌体湿重2g | 菌体湿重4g | |
超长ONT测序 | 菌体湿重3g | 菌体湿重6g | |
样本准备方法 | |||
样本收集 | 建议使用液体培养基摇菌培养，待长成1-3mm的小颗粒后，取适量菌液于 15或 50ml 离心管中，5000rpm/min离心5 min收集菌体（若菌量较少，可多次离心富集或过滤收集），加入适量1x PBS缓冲液（Ambion，货号:AM9624）冲洗多余的培养基，将收集到的菌体置于无尘纸上轻轻挤压去除水分，随后将样本收集到无菌的 1.5ml 离心管中。 | ||
注意事项 | 1. 不建议使用野外采集的大型真菌，可能会有内生菌共生菌等污染； 2.培养菌体的时间不宜过长，一般培养至对数生长中期时收集菌体，不能存在明显的胞外多糖等分泌物，如果菌体的生长速率较慢，建议采用大量接种的方法缩短培养时间。 | ||
病毒样本 | |
样本收集 | （1）RNA病毒需要反转录成单链cDNA或者双链cDNA（推荐送双链cDNA）才能送样，公司不做反转录这一步； （2）文库类型怎么选择？老师送单链cDNA——单链cDNA文库，双链cDNA——双链cDNA文库，双链DNA病毒——PE文库。 |
注意事项 | 公司不接收病毒原样，只接收核酸样本。 |
3、医疗样本
医疗样本 | |||
测序平台 | WGS\WES最少送样量 | WGS\WES建议送样量 | 样本保存与运输 |
人组织样本 | 手术新鲜组织黄豆大小2-3块; 穿刺组织长度至少1cm 2-3条; | 组织样本、细胞样本、唾液样本：样本收集后液氮速冻15min，-80℃冰箱保存，干冰运输； 血液样本：保存在-20°C冰箱，冰袋运输； FFPE类样本：室温储存及运输。 | |
细胞样本 | 细胞数量级大于 107 | ||
血液样本 | 1ml | 3ml | |
唾液样本 | 1ml | 3ml | |
FFPE 类样本 | 石蜡块：2年以内标准程序制备的石蜡块，蜡块中组织体积大于1cm3。 石蜡组织切片：2年以内标准程序制备的石蜡组织切片，未染色的白片，厚度：5-10µm，表面积大于1cm2，10 片及以上（如切片厚度或表面积达不到要求需按比例增加切片数量）。 | ||
样本准备方法 | |||
样本收集 | 细胞样本：选取生长状态良好的细胞样本，细胞数量级大于107，200g离心5min，去上清；加入适量1xPBS清洗细胞，200g离心5min，去上清，清洗2次，-80℃保存，干冰运输； 血液样本：采集新鲜血液 2-3mL于抗凝管中（推荐使用 EDTA 抗凝管（紫色盖子采血管）），立即充分混匀样本。由于会影响提取效果，不能使用肝素抗凝（绿色、棕色盖子采血管）。 唾液样本：收集唾液样本前的 15 分钟内，请勿进食、吸烟、嚼口香糖和饮水。在收集唾液样本前，请用饮用水将口腔内的杂物洗漱干净（注：为保证收集的唾液中富有足够量的细胞，建议漱口时间为收集唾液样本的前 30 分钟）。确认唾液采集管的外包装完好； | ||
注意事项 | FFPE 样品提取的质量取决于固定和包埋过程的处理，样本如果未处理好，会造成核酸严重片段化； | ||
4、核酸样本
DNA 样品送样要求：
1.DNA 样本需主带清晰，无杂质。
2.样本体积不少于 15μL，必须用 1.5ml 或 2.0ml 离心管装载核酸样品；为防止样品管破裂、污染或混乱等，请不要使用诸如 PCR 管、0.5ml EP 管、八联管、96 孔板、深孔板等非标准管送样。
3.避免紫外照射，不可反复冻融，不可存放于高温状态，不可存放于极端PH溶液中（PH<6 或 PH>9）。
4.样品溶液澄清无色，无不可溶解物质，无 RNA 污染。
5.样品 A260/280=1.8~2.0，A260/230≥2，样品 NanoDrop 所测浓度与 Qubit 所测浓度比值（简称 Na/Qu）低于 1.2。
二代测序核酸要求 | ||||
编号 | 文库类型 | 样本/组织类型 | 最低浓度要求 (ng/μl) | 单次建库总量要 求(μg) |
1 | Pair-end | 常规PE文库 | 1 | 0.05 |
微量PE文库 | 0.5 | 0.005 | ||
2 | dd-RAD | dd-RAD文库 | 12 | 0.5 |
3 | 全外显子 | 全外显子文库 | 5 | 0.5 |
4 | PCR-free | PCR-free文库 | 10 | 1 |
5 | cDNA | 双链cDNA文库 | 2 | 0.2 |
单链cDNA文库 | 2 | 0.2 | ||
6 | SSR | SSR文库 | 5 | 0.5 |
7 | 扩增子 | 扩增子文库 | 1 | 0.015 |
三代核酸送样要求 | |||
测序平台 | 物种 | 文库个数 | DNA用量 |
Pacbio Revio | 动植物、微生物 | 1 | 10ug（纯化后） |
PromethION | 动植物基因组 | 1 | 10ug（纯化后） |
真菌基因组 | 1 | 3ug（纯化后） | |
细菌基因组 | 1 | 3ug（纯化后） | |
注：
1）具有致病性及传染性的 DNA 病毒类样本请在订单中标明；
2）如果DNA溶液中存在杂质，实验室会进行磁珠纯化提高纯度，根据 DNA 溶液的纯净度会有20-80%的损耗，DNA 里面杂质越多损耗越大，总量是否合格需根据纯化后的结果判定。
