2024-08-13
代谢组学样本的收集是整个研究过程中的关键环节，样本的收集和处理直接影响代谢物的稳定性和检测的准确性，影响着研究的有效性和可靠性。合理的样本选择和收集策略能够确保所研究的代谢物反映整个生物体或特定组织的真实状态，提高数据的可靠性，增强研究结果的普遍适用性。代谢组学的研究样本主要有动物或临床血样（血清、血浆）、尿液、粪便、肠道微生物、组织、细胞、土壤、植物器官、微生物细菌、真菌及其发酵液等等。本文汇总了代谢组学样本收集的基本原则、各种样本的取样方法及科研工作者常遇见的问题，供大家参考和查阅。
样本收集原则 无菌操作：手术器械、容器等材料必须保持洁净，避免污染。 一致性：取样人员尽可能使每组样本在取材部位、组织块大小、时间及处理条件等方面保持一致。 迅速性：保证质量的前提下在样本采集、制备、冻存的过程中提高速度，尽可能减少操作时间，确保样本的真实状态。 除杂：去除与实验无关的杂质，如动物组织去血、植物组织去除泥土等污染物、菌体及细胞去除培养基等，推荐使用PBS缓冲液或者生理盐水，吸水纸吸干残留液体。 全程低温：样本离体后，如有分离步骤可在4℃或冰上进行，分离好的样本立即置于液氮中速冻，-80℃保存，干冰运输。 分装：提前规划好实验用量，避免反复冻融。 样本足量：应检测要求、生物信息学分析要求及项目结果准确性等，各个类型样本的送样量及生物学重复最好大于其对应的建议量。 标记清晰：确保样品管质量可靠、避免标签脱离或标记消融等，以免混淆样本。
不同样本收集流程 一、血液样本（血浆/血清） 1.血浆 样本收集步骤： 用抗凝管（代谢组学研究建议 EDTA，不推荐柠檬酸钠）采集血液，采血后立即轻轻颠倒混匀采血管 5-10 次，以确保抗凝剂发挥作用；采血后需在30min内尽快离心分离出血浆（若不能尽快离心，采集的血液需放在4℃冰箱保存，并必须在4h内完成离心及分装），4℃条件下3000 rpm离心10 min-15 min，吸取适量上清液（即血浆）置于合适的已编号的EP管中；如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血浆保存于-80℃冰箱中。 2.血清 样本收集步骤： 用不含抗凝剂的样本收集管采集血样，或将采好血样的采血管室温静置（注意：不能振摇采血管）；静置30 min-60 min使其凝结后，再将采血管放入冷冻离心机内，4℃条件下3000 rpm，离心10 min-15 min，吸取上清液（即血清）分装于合适的已编号的EP管中；如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血清保存于-80℃冰箱中。 注意事项： （1）血浆参考产率≈50%，例如1mL全血大约能得0.5mL血浆。 （2）血清参考产率≈30%~50%，例如1mL全血大约能得0.3~0.5mL血清。 （3）采集到的血清为黄色透明液体、血浆为淡黄色半透明液体，如果发现样本中是红色，说明已经发生了溶血现象，样本需重新制备。 二、其他体液样本（尿液/唾液/痰液） 1.尿液 样本收集步骤： 取晨起中段尿（临床）或晨间 1h 尿（动物），3000rpm，4°C 离心 10min，将澄清尿液分装到离心管中，做好标记后，液氮速冻15min，于-80℃下保存。 注意事项： （1）动物1小时尿量不够，可分多次收集，如果需要收取24h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收集，并及时冻存样本。 （2）不推荐使用抗菌剂，使用无菌的采集容器，确保样本不受外部环境的污染。 （3）受试者应避免在采样前夜食用可能干扰代谢分析的食物或饮料（如酒精、咖啡等）。 2.唾液 样本收集步骤： 唾液样本需在静息状态下进行收集，在收集唾液样本前，请用饮用水将口腔内的杂物洗漱干净。确认唾液采集管的外包装完好；检查唾液采集管中的保存液，确认无漏液，确认保存液中没有沉淀析出，低温冻存寄送。 注意事项： （1）收集前至少2小时避免禁食禁烟禁水等（尽量不要接受外界刺激，建议晨起收集）。 （2）为保证收集的唾液中富有足够量的细胞，建议漱口时间为收集唾液样本的前30分钟。 3.痰液 样本收集步骤： 采样前12h禁食，清晨痰量多，可作为取样时间；采集前应进行漱口，以除去口腔中细菌；深吸气后用力咳出1－2口痰于广口无菌瓶中，痰量极少可用45℃ 10%氯化钠溶液雾化吸入导痰；添加质量体积为0.5/1000（w/v）的叠氮化钠，用注射器将痰液来回抽提并打出，使得痰液混匀；-80℃冻存，足量干冰寄送。 三、人/动物组织样本 适用于脑、心脏、肝脏、肾脏、肌肉、皮肤、血管、软骨等。 样本收集步骤： 根据具体实验设计准确切除所需组织，迅速剥去非必需的脂肪和结缔组织等；用预冷的PBS缓冲液或生理盐水清洗干净，以去除血液残留和污物；用干净的无尘吸水纸吸干水分，根据实验设计将组织分装待用；管子上做好标记后放入液氮中冷冻处理至少 15min，-80℃冻存，足量干冰寄送。 四、粪便与肠道内容物 1.人粪便 样本收集步骤： 采样时间为早上和中午较好，采集前先排尿，将粪便于清洁干燥的容器中，采用无菌小勺、手术刀或粪便取样器等工具，挖取排泄中后部的内侧粪便，混合均匀后分装为多份。称重记录，采集量需达到样本量要求。可每例样本准备多管备份，液氮速冻后-80℃保存。 2.小鼠粪便 样本收集步骤： 待测的小鼠排便后，立即用灭菌的镊子夹取；收集小鼠粪便6-8粒，转入冻存管；为避免反复冻融，样本可用无菌棒混合均匀后进行多管分装；-80℃冰箱冻存。寄样需足量干冰。 注意事项： （1）粪便样本尽量不要接触到尿液，避免多样本交叉污染，且尿液中含有大量尿素，会干扰后续粪便样本检测。 （2）人粪便样本提供者在取样的近三个月内不可接受抗生素治疗。 3.肠道内容物 样本收集步骤： 使用无菌的解剖刀，尽量在无菌状态下取出整个肠道，将实验所需的肠段的内容物切下，将内容物取出放置在无菌离心管中，建议分装保存，便于后续实验需求，低温保存运输；若是无法立即抽提，建议将样本先置于液氮中冷冻4小时以上，保证冷冻充分再转移到-80℃保存。 五、土壤 样本收集步骤： 取样区域一般是根据实验设计进行选择，建议选取具有代表性的土壤；采样时使用的所有工具、采集袋或其他物品均要使用已灭菌的；若野外没有合适的条件进行灭菌处理，可以使用采集的土壤对取样工具进行擦拭，尽量去除干扰；采集时一般选取5-10 cm处土壤，去除杂质，将一定量的土壤进行分装标记，密封后立即低温保存。 六、细 胞 1.贴壁细胞 样本收集步骤： 从培养箱中取出用于计数的细胞样本，去除培养基后用PBS洗一遍，去除PBS，之后加胰蛋白酶消化后计数，得到细胞数目，接下来开始处理正式实验用的样本；去除培养基，加PBS洗2-3遍后彻底去除PBS。 方法1：加入1 mL预冷的PBS溶液，快速用细胞刮将细胞刮下来，收集到离心管中，低速离心1 min，弃去上清，收集细胞沉淀于2 mL进口离心管中，液氮速冻15 min，-80℃保存，足量干冰运输。 方法2：加入1 mL预冷的LC-MS级别的甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v，代谢组）快速用细胞刮将细胞刮下来，收集到进口离心管中，加封口膜密封好，送样前置于-80°C保存；足量干冰运输。 注意事项： 对于贴壁细胞的代谢研究，不建议使用胰蛋白酶消化。 2.悬浮细胞 样本收集步骤： 离心去除培养基，PBS洗2-3遍后离心去除PBS，液氮速冻后置于-80°C暂存。 七、植物组织 1.叶片、茎、花 样本收集步骤： 取整片叶片/一段茎/一朵花，用锡箔纸包裹并标记后，迅速放入液氮中冷冻处理至少15min。取出后迅速放入自封袋中(每组一袋)，在自封袋中放入标签纸注明样本信息。迅速放入-80°C冻存，干冰寄送。 注意事项： （1）采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。 （2）要根据实验设计，采集样本时保持样本一致性，尤其是同一组样本（如颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等）。 2.根 样本收集步骤： 取整株植物的根部，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土。根据具体实验设计取植株根特定的部位，样本装入离心管中。标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。-80 °C冻存，干冰寄送。 注意事项： （1）PBS漂洗要快。 （2）由于根部组织特别脆弱，被挤压后会变成浆糊状，所以推荐保存至离心管中，而不是锡箔纸包裹。 （3）植物各类组织样本建议都使用超纯水进行漂洗完之后，再研磨分装冻存，防止因种植过程中施加的一些肥料、农药等含有表面活性剂或其他杂质，对后续实验造成影响。 3.果实、种子 样本收集步骤： （1）对于含多汁、块头较大的果实（番茄、西瓜、苹果等）需要先用锋利的刀分割成“均匀”合适的小块（≈200 mg/样本）分装至2 mL离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。 （2）对于细小的颗粒种子（拟南芥种子、谷物种子等），可以先将同一组的植株种子混匀后再分装（≈200 mg/样本）至离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。 （3）对于要求对整个果实进行提取的（整粒葡萄等），需要把果实装在50 mL离心管中/自封袋中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。 注意事项： （1）对多汁的果实进行取样很难保持均一性（如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比），建议将整个果实进行研磨、冻干，对粉末进行称重分装。 （2）不推荐用锡箔纸包裹。 八、微生物样本 1.细菌/酵母菌体 样本收集步骤： 取生长到一定程度的菌液，测OD值，用培养基将各个样本的OD值调到一样，保证取样的菌体数目均一。取1个15 mL离心管，称量并记录离心管的重量a。取5 mL的等量菌液加到上述离心管中，离心后弃培养基，再用生理盐水或者PBS洗2-3遍，洗去残留培养基，离心去上清，保留菌体沉淀，用枪头彻底去除液体，再次称量并记录重量b，用b-a得到菌体湿重，看是否达到送样量要求， 如果不够的话继续取菌液离心直到达到送样量要求。记录达到送样量要求所需要的菌液体积。对剩下所有菌液样本都取上述记录的体积，离心去除培养基，生理盐水或者PBS洗2-3遍，用枪头彻底去除上清。菌体沉淀连同离心管一起放进液氮中速冻，之后置于-80℃冰箱中保存。 2.固体真菌 样本收集步骤： 称量固体真菌样本于离心管中，达到送样量要求。菌体连同离心管一起放进液氮中速冻，之后置于-80℃冰箱中保存。
常见问题解答 1、为什么要避免反复冻融？ 代谢组学样品应尽量避免反复冻融，这是因为环境温度及变化均会对生物体内的小分子代谢物产生影响[1]。因此，我们建议在存储前有计划地将样品提前分装好，尽量避免反复冻融。 2、存储条件对代谢物的影响？ 样品长期存储于液氮中是最理想的存储方式，但是需要不断补充液氮，操作成本高。实验室中最常见的存储方式是-20℃和-80℃冰箱。研究表明，经过长达6个月的存储以后，除部分代谢物（如蛋氨酸、B族维生素、DHA和EPA）在-20℃下存储3个月以上会发生显著降解，-20℃和-80℃存储的样品整体代谢轮廓没有明显差异，且和收集当天较为类似[2-4]。因此，推荐将样品存储于-80℃冰箱，并尽快送检。 3、选择血清还是血浆？ 全血的稳定性差，存在异质性，所以一般检测中避免使用全血而选用血浆或血清。血清和血浆样本都被广泛用于代谢组学研究，整体而言，血清和血浆的代谢物种类差异不大，但是多数代谢物在两种样本中浓度差异较大[5-6]。因此，对于同一个研究项目而言，我们选择同一类型的血液样本（血清或血浆）。 4、血浆或血清溶血的影响？如何避免溶血？ 溶血可以引起苯丙氨酸、鸟氨酸、柠檬酸、琥珀酸、磷脂以及鞘脂等多种代谢物的改变[8]。为了避免溶血，在制备血清血浆样本时应注意离心速度和时间，避免转速过高；在采集血液过程中避免剧烈晃动；每管加入蛋白酶抑制剂可以有效地保护蛋白质完整性、提高实验数据的准确性和可靠性，并且有助于延长样品的保存时间。 5、如何选择抗凝剂？ 常见的抗凝剂有三种：EDTA、柠檬酸、肝素盐。其中，柠檬酸和EDTA是通过钙离子鳌合作用而抗凝，而肝素是通过激活抗凝血酶，抑制凝血因子而抗凝。柠檬酸是TCA 循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染；EDTA在NMR上会产生很强的噪音信号[9]。而肝素盐抗凝管会在液质上产生严重的干扰信号[5,8]。若选择质谱作为代谢组学检测平台，我们推荐EDTA作为血浆抗凝剂。 6、为什么尿液收集不推荐加抗菌剂？ 由于尿液中细菌生长迅速，有些研究会在尿液中添加如硼酸和叠氮化钠等抑菌剂保护尿液样本不被污染。但这些外来化学试剂的添加不可避免地会对尿液中的代谢物产生不利影响。已有研究表明，尿液样品在低于-25℃条件下储存时，添加抑菌剂和不加抑菌剂，样品的代谢轮廓没有差异[10-11]。因此，我们不建议在尿液样品中添加如叠氮化钠等抑菌剂。 7、不同部位的粪便样本有无影响？ 有影响，且在不同个体之间差异和影响不一致。因此，建议对于单个样本量大的粪便样本，在低温储存前用无菌棒混匀取适合的量储存。而单个样本量少的样本，可以整个储存，后续检测时再混匀。 8、为什么对于贴壁细胞的代谢研究不建议使用胰蛋白酶消化？ 胰蛋白酶会造成细胞膜发生透化，促使代谢物渗漏出细胞，流向细胞外部，导致细胞内代谢物耗尽的“代谢物渗漏”现象。同时，胰蛋白酶消化还会刺激脂肪酸和能量利用相关的代谢物丰度信号剧增，造成胰蛋白酶化过程中出现代谢物的假阳性差异。可采用细胞刮棒的物理方式消化和解离细胞，尽量减少胞内代谢物的损失，获取更多的代谢物信息。
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