2017-04-12
SMRT（Single Molecule, Real-Time）测序，即单分子实时测序，该方法基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。Pacific Biosciences自2013年成功推出商业化的三代测序仪PacBio RSII后，三代测序开始被广泛应用于基因组学、转录组学研究中。三代测序技术通过其独有的环形一致性测序模式（Circular-consensus sequence，CCS），极大提高单碱基测序的准确率，远超Illumina等二代测序技术。与传统转录组测序项目相比，利用PacBio平台的全长转录组测序技术可以直接获得mRNA的全长，保证了mRNA序列的精确性。
2017年2月，美国弗吉尼亚理工大学发表题为Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi的文章，以斑须按蚊为材料，通过全长转录组测序，揭示基因的反式剪接事件，并优化和提升了基因组的注释。
1. 研究目的
第三代测序技术与二代测序技术在读长上有明显优势。期望利用三代测序技术的优势提升斑须按蚊的基因组注释信息并获取cDNA的全长；另一方面，反式剪接为物种进化过程中发生的现象，与常规的剪接方式不同，反式剪接可由来自于不同mRNA前体的外显子区域生成，本研究拟通过全长转录组测序，揭示反式剪接现象。
2. 研究方法
取15头1-3日龄雄成虫进行混样，提取总RNA后，利用SMRTer PCR cDNA synthesis试剂盒将mRNA进行反转录获得cDNA，将构建好的文库用PacBio平台进行测序。
3. 分析结果
通过全长转录组测序，共得到超过60万条全长cDNA；通过全长转录组测序，4867个基因模型升级。全长转录组新增了3323个基因mRNA的UTRs信息；新发现了1785个可变剪接并界定了外显子的边界；1923个基因重新对外显子进行了调整或明确发生基因融合；鉴定出6个反式剪接事件。
作者以doublesex基因为例说明对基因组注释的改善。在原有的基因注释信息中，doublesex基因分为两部分，命名为ASTEI07080和ASTEI07082，通过全长转录组测序，将这两部分基因合并为一个基因模型。
4. 参考文献
Jiang X et al., Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi. Insect Molecular Biology (2017).
