2024-11-18
文章题目：High-throughput profiling of antibiotic resistance gene dynamic in a drinking water river-reservoir system
期刊：Water Research
发表时间：2019年2月
●●● 研究背景 ●●●
抗生素耐药性及其相关基因（ARGs）的日益增加与传播，已成为21世纪全球公共卫生领域的一大严峻挑战。值得注意的是，抗生素耐药性的存在并非新近现象，而是一个古老且自然的过程。然而，自1942年青霉素首次应用于临床以来，由于现代抗生素的过度使用和不当应用，导致ARGs的快速演化与广泛扩散。河流生态系统尤其容易受到人类活动的影响，例如畜牧业、农业和城市污水排放等，均会将各类化学与生物污染物引入河流领域。最新研究表明，我国每年大约有24,748吨抗生素及9.47×10^13个ARGs单位/人/日被排入河流及其相连的水体之中。相比之下，多数水库地处偏远且未受严重干扰的自然环境中，除了接收来自上游河流的来水之外，基本不会受到其他类型的人为活动影响，因而常被视为关键的饮用水源地。因此，在抗生素与ARGs污染程度上，水库水体通常比河流系统要低得多，显示出更好的水质状况。
以往的研究主要集中在河流、水库、河口以及人工水体中抗性基因（ARGs）的出现与分布情况。尽管河流-水库系统在生态上的重要性已得到广泛认同，但关于这一系统中ARGs的具体分布特征，仍缺乏足够的研究。值得注意的是，现有的文献虽然总结了影响不同环境ARG动态的关键因素，但在某些方面结论尚存分歧。此外，关于这些因素如何具体影响ARGs的研究，特别是基于实地数据的研究，依然相当稀缺。因此，对河流-水库系统内ARGs的谱型及其影响因素进行全面调查至关重要。这不仅有助于深化我们对自然水体中ARGs行为模式的理解，填补现有的知识空白，更为应对日益严峻的抗生素耐药性挑战提供了科学依据，助力制定有效的管理措施。
●●● 研究思路 ●●●
选址和取样：亚热带河流-水库系统中进行样本采集，覆盖流域面积5150 km2。这一水系位于人口密集区域，由两条主要支流构成，正面临严重的非点源污染问题，包括但不限于工业废水排放、畜牧业废水以及农业径流。这些污染物最终汇入一个位于较为原始地带的大型深水库。总体而言，本研究探讨的环境梯度涵盖了从河流到水库水系间水文条件的变化及人类活动强度的不同，这一现象在其他流域中也普遍存在。调查分别在三个季节开展，从8个不同采样点收集地表水、中层水和底水，制成复合样本。所有样本在分析前即刻送往实验室，并在4ºC的条件下保存。
DNA提取与处理：使用EZNATM Soil and EZNATM Water DNA Kits (OMEGA, USA)试剂盒，然后将合格的DNA调整至50 ng/μL，保存于- 80ºC
QPCR芯片：Wafergen SmartChip Real-time PCR system 用于荧光定量分析。296对引物使用于本研究中，其中包括285个抗生素类的ARGs、9个MGEs（8个转座酶,1个通用的I类整合子整合酶基因 cintI-1 ）、1个临床I类整合子整合酶基因 intI-1和16S rRNA基因。基因拷贝数按下式计算。Gene Copy Number = 10(31−Ct)/(10/3)。为了保证数据的准确性与可靠性，所有样本均进行了三次技术重复。
同时，研究细菌16S rRNA基因测序。测定水样中溶解有机碳，溶解总氮（DTN）和总磷（DTP）含量。基于对中国抗生素使用情况的调研，选取了17种代表性的抗生素作为靶化合物，包括磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲氧嘧啶（SMM）和磺胺喹啉（SQX）等。
●●● 数据分析 ●●●
Fig 1. (A) 在河流与水库水系采集的水样中，检测到的ARGs和MGEs（在亚型水平上）的数量。根据ARGs产生耐药性的抗生素进行分类：氨基糖苷类、β -内酰胺酶、氯霉素、大环内酯-林可酰胺类-链霉素B （MLSB）、多药磺胺类、四环素、万古霉素或其他。(B) 维恩图展示了河流系统与水库系统间共有及独有ARGs数量。河水（n = 24）；水库（n = 15）。
Fig 2. 16S rRNA （A和D）、ARGs （B和E）和MGEs （C和F）不同季节与环境梯度下绝对丰度变化。采用Kruskal-Wallis检验确定对变异检验的显著影响（*:P < 0.05, **:P < 0.05）。
Fig 3. (A) 河流水系和水库水系的抗生素浓度。(B)河流水系和水库水系中抗生素浓度与各类ARGs、MGEs和intI-1绝对丰度之间的Pearson相关性。右下为相关系数的色带指标（*:P < 0.05, **: P < 0.01）。白框表示各参数间无显著相关性（P > 0.05）。∑ARGs：ARGs总和。∑Antibiotics：抗生素总和。
●●● 总结 ●●●
降雨引发的季节性径流可能显著影响抗性基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）的丰度。然而，河流与水库系统间存在的环境梯度对ARGs及MGEs的多样性、相对丰度及其分布的影响更为深远。这些环境梯度不仅能够显著改变致病菌群落与非致病菌群落的分布格局，还会影响ARGs亚型之间以及MGEs间的共存模式。结构方程模型分析显示，在河流-水库系统中，MGEs对抗性基因谱型的形成起着最关键的作用。此外，环境梯度可能通过调节MGEs、抗生素浓度、致病菌群落及非致病菌群落等因素，进而驱动该系统内抗性基因谱型的变化。
