2024-11-22
一、冻存组织抽核（动物篇）简介
在前几篇文章中，小派向大家介绍了多种组织解离的相关方法，但在单细胞测序实验中，并不是所有类型组织均可通过解离的方式得到完美的细胞悬液，且不同单细胞测序平台对于细胞直径也有限制。比如胰腺因存在内源性酶，而导致解离过程中细胞活性下降过快；心肌及脂肪等组织细胞直径过大无法满足单细胞平台要求等。
此外，组织解离对于新鲜程度也有所要求，而如果进行单细胞核转录组测序，我们便可避开上述解离难点及直径大小限制，同时组织也可以通过低温冻存方式寄送。接下来小派将以人胰腺癌，蛙内耳，鸡贮精腺三种冻存组织为例，向您展示动物冻存组织的单细胞核悬液制备。
二、解离方案
1.实验试剂配置：（1）适当体积裂解液，冰上预冷 （2）适当体积清洗液，冰上预冷 （3）适当体积重悬液，冰上预冷 （以上试剂均适量加入RNA酶抑制剂）
2.取样裂解：将剪刀镊子等放置于干冰预冷，随后镊子夹取冻存管中组织，置于含1-2ml裂解液的离心管中，视组织大小进行剪切，然后转移至玻璃匀浆器中，使用不同直径的玻璃棒进行数次挤压，冰上静置数分钟，期间台盼蓝镜检观察细胞裂解程度。
3.终止清洗：镜检观察到大量细胞核被裂解释放时，即刻加入3-5ml清洗液终止裂解，过筛收集后，4℃ 500×g 离心5 min，弃上清。
4.重悬镜检：适当体积重悬液进行重悬后，台盼蓝镜检观察悬液背景，若碎片数量过多，则进行后续去碎片操作或流式分选；若碎片较少，视细胞核悬液状态决定是否再次清洗；若结团率高可过20um细胞筛等。
5.计数镜检：荧光计数细胞核悬液后，调整浓度并结合镜检状态合格即可。
三、结果展示
镜检结果
三组样本镜检背景干净，无明显杂质
浓度检测
胰腺癌组织，浓度1130 个/ul，总量11万左右。
鸡贮精腺组织，浓度1320个/ul，总量15万左右
蛙内耳组织，浓度772个/ul，总量10万左右
数据质控
上图是下机数据cellranger质控结果，细胞捕获数及基因数都符合前期需求。
