2024-12-17
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征（一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质）包括蛋白质的表达水平，亚细胞定位，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢、生长发育以及各种胁迫反应等过程的整体而全面的认识。
TMT、LFQ和DIA是目前最常用的三种基于质谱的高通量蛋白质组学定量方法。老师们在第一次接触蛋白质组学的时候，对于不同检测原理及定量方式一头雾水。
什么是标记定量？什么是非标记定量？什么是4D蛋白质组？为什么大家都在做Astral-DIA蛋白质组？本次由小派带各位老师走进蛋白质组学，围绕这三种常见检测技术与一系列问题展开深度解析。
图1 派森诺蛋白组产品总览
一、蛋白质组学常用检测技术盘点
1.TMT（Tandem Mass Tag，串联质量标签）
利用TMT标记试剂对肽段进行标记，该类标记试剂结构，由标记基团，反应基团和平衡基团构成。不同的标记试剂具有相同的分子量，但其含有的标记基团分子量不同，因此以不同标记试剂标记不同样品后，混合肽段在进入二级质谱扫描前，会于碰撞室中释放标记基团，并在二级谱图中显示出不同的标记基团信号。根据不同标记基团的信号强度，可以获得样品间同一肽段的定量信息，可进一步转化为蛋白质的定量信息。
衍生产品：TMT标记定量蛋白质组学（仅限Thermo平台）
图2 TMT检测流程
2.LFQ（Label Free Quantification，非标记定量）
广义的LFQ技术包括所有不涉及稳定同位素标记的蛋白质组定量方法，比如早期基于二级谱图计数、肽段数、各类蛋白得分进行的蛋白质定量，或近年来应用较多的DIA定量技术。但狭义上，LFQ是基于质谱检测采集的一级谱图和二级谱图可分析提取离子色谱图(XIC)，峰面积可用作反应样品中相对肽段乃至蛋白含量的定量信息进行归一化处理，即可对不同样本中检测到的同一肽段乃至蛋白进行相对定量。
衍生产品：Label free非标记定量蛋白质组学（Thermo）/4D-Label free非标记定量蛋白质组（Bruker）
图3 Label free检测流程
3.DIA（Data-Independent Acquisition，数据非依赖性采集）
DIA定量策略是一种非数据依赖型的质谱数据采集方式，在目前常用的大部分质谱定量和鉴定方法均采用的是数据依赖性采集方式(DDA)，会选择一级谱图中信号较高的离子进行二级质谱扫描，因而可能损失大量低丰度肽段的信息扫描，随机性也较高。而DIA定量策略与之不同，会将一级质谱检测到的所有离子分段进行二级质谱扫描检测，并根据二级质谱中碎片离子的信号强度对其相应的肽段乃至蛋白进行定量。
衍生产品：DIA定量蛋白质组学（Thermo）/4D-DIA定量蛋白质组（Bruker）
图4 DIA检测流程
二、DDA和DIA数据采集模式区分
（1）DDA模式下，质谱根据离子化的肽段母离子的强度，选择TopN个（一般20~40）强度最高的离子进入二级质谱，进行进一步碎裂，然后经过与蛋白质数据库对比，来鉴定蛋白质。这种方法无疑丢失了大量有用的肽段母离子信息。
此外，经过二级碎裂的二级谱图，在后期使用软件鉴定中也仅有少量谱图得到解析（约30%~50%），大部分谱图依然得不到有效利用。由于质谱选择离子的随机性，造成鉴定的重复度较低。又由于空间电荷的存在，大大限制了分析的动态范围，因而无法解析一些重要的低丰度蛋白。
（2）DIA技术具有全景扫描、定量准确性高、数据利用度高等优势，其二级离子碎裂不依赖于一级碎裂的结果。而是根据质荷比把质谱扫描范围分成若干个窗口，对每个窗口中所有的母离子碎裂并检测，采集所有肽段离子的二级谱图信息进行蛋白质定性和定量。
不建库的DIA方法被称为DirectDIA或library-free DIA，就是不依赖于DDA检测建库的DIA（DDA library-free DIA）。在早期的DIA方法中，由于DIA二级谱图过于复杂，难以进行谱图解析，因此会先使用DDA检测建立二级谱图库来辅助谱图解析以提取定量数据。这种处理方法导致了DIA定量方法复杂程度的提升，同时也使其定量数据质量严重依赖于DDA检测建立的谱图数据库，一定程度上难以发挥DIA检测的优势。随着近年来DIA分析算法的改进和优化，不依赖于DDA谱图库的DIA定量分析算法越来越完善，也得到越来越广泛地应用。
图5 DDA与DIA数据采集
三、4D蛋白组与Astral蛋白组
（1）4D蛋白质组：专指采用4D质谱平台（Bruker timsTOF系列）进行的蛋白组学检测。为什么会称为4D呢？因为布鲁克这款质谱仪在原理上除了保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）之外还增加了第四维的离子淌度（mobility）的分离。相比传统3D平台，4D平台离子利用率和准确度更高，能以更少的上样量，实现高灵敏度、高通量、高精确度的蛋白检测。
图6 4D蛋白组平台检测优势
（2）Astral-DIA蛋白质组：专指采用赛默飞的Orbitrap Astral平台进行检测的DIA蛋白质组。集四极杆质量分析仪、Orbitrap质量分析仪、Astral质量分析仪于一体，完美融合三大质量分析器，能够快速获取高质量、高分辨率、高灵敏度和宽动态范围的精确质量（HRAM）数据，最大限度提升解决方案的性能和可用性。在检测通量、蛋白组覆盖深度、灵敏度及精准定量等多个维度具有卓越性能。
图7 Astral-DIA蛋白组平台检测优势
四、小 结
各位老师看完以上的知识分享后，相信大家都是收获满满，综上所述，咱们把不同检测技术与平台汇集成列表，更加直观的方式帮助各位老师理解并区分各个产品。
图8 不同检测技术的区分（简版）
图9 不同检测技术的区分（详版）
图10 不同仪器平台比较
