2024-12-20
随着环境污染问题的日益严重，环境微生物的检测变得越来越重要。环境微生物不仅对生态系统的平衡起着关键作用，而且一些致病微生物还会对人类健康造成威胁。传统的微生物检测方法如培养法、显微镜观察法等存在操作繁琐、耗时较长、灵敏度低等缺点。而 ELISA（酶联免疫吸附测定） 作为一种快速、灵敏、特异性强的检测技术，在环境微生物检测中得到了广泛的应用。
一、Elisa检测技术原理
酶联免疫吸附测定（ELISA），指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原与抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。最早是由瑞典学者 Engvail 和 Perlmann，荷兰学者 Van Weerman 和 Schuurs 于 1971 年报道的一项成果。
ELISA 的基本原理有三条：
1、抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
2、抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
3、酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。常见测抗原的方法有双抗体夹心法、双位点一步法；测抗体的方法有间接法、双抗原夹心法；既可测抗原又可测抗体的方法有捕获法、竞争法。
二、ELISA 在环境微生物检测中的应用
1、水质检测
检测水中的细菌和病毒：快速检测水中的大肠杆菌、霍乱弧菌、脊髓灰质炎病毒等致病微生物，为水质监测和饮用水安全提供保障。
检测水中的藻类和蓝细菌：检测水中的微囊藻毒素、节球藻毒素等藻类毒素，以及蓝细菌产生的肝毒素和神经毒素，为水环境生态风险评估提供依据。
2、土壤检测
检测土壤中的病原菌：检测土壤中的真菌、细菌和病毒等病原菌，如根腐病菌、青枯病菌、烟草花叶病毒等，为土壤病害的诊断和防治提供支持。
检测土壤中的有益微生物：检测土壤中的固氮菌、解磷菌、硅酸盐细菌等有益微生物，为土壤肥力的评价和改良提供参考。
3、空气检测
检测空气中的真菌和细菌：检测空气中的曲霉、青霉、葡萄球菌等真菌和细菌，为室内空气质量监测和空气污染控制提供手段。
检测空气中的花粉和过敏原：检测空气中的花粉、尘螨、动物皮屑等过敏原，为过敏性疾病的预防和治疗提供依据。
三、Elisa检测环境微生物的优势
1、高灵敏度与特异性
ELISA 能够检测低浓度的目标抗原或抗体，即使是在复杂的环境样本中，也能准确地区分和测量特定的分子，这是由于抗体对抗原的高度特异性所决定的。例如在环境科学领域，ELISA 技术被用于检测环境污染物的残留量、水体中病原微生物的检测等，能够准确地检测出微量的目标分子。
2、应用范围广泛
ELISA 被广泛应用于多个领域，包括临床医学，可用于疾病诊断，如 HIV、乙肝、丙肝、梅毒等传染病的筛查；科学研究中可用于基础免疫学、生物标记物探索、药物作用机制研究；在环境保护方面，可用于水质、土壤污染的监测，重金属、农药残留的检测；食品安全领域可用于食品添加剂、过敏源、病原微生物的检测；农兽医领域可用于动植物疫病监控，饲料、药品残留分析。
3、操作流程简便、快速、标准化
ELISA 试剂盒通常包含完整的检测组件，操作步骤标准化，易于培训和执行，即便是没有丰富实验经验的人员也能顺利进行检测。例如在食品微生物检测中，酶联免疫吸附（ELISA）法以显色为依据实现检测，形成了具有特殊性的分析方法，操作流程相对简便。
4、可自动化
ELISA 可以与自动化设备配合使用，大大提升了检测效率和通量，适合大规模筛查和高频率监测场合。在环境微生物检测中，与自动化设备配合能够快速处理大量样本，提高检测效率。
5、数据量化分析
ELISA 提供了定量分析的可能性，通过标准曲线可以直接计算出待测物质的浓度，为后续的数据统计和深入研究奠定基础。在环境微生物检测中，能够准确地确定待测物质的浓度，为环境评估提供有力的数据支持。
6、稳定性和重复性佳
只要遵循正确的储存和操作指导，ELISA 试剂盒能够保证检测结果的稳定性和一致性，利于长时间内的数据比较和跨实验室间的交流，稳定的检测结果有助于科学研究的准确性和可靠性。
四、环境微生物的 Elisa 检测步骤
包被过程，将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，加入到酶标反应孔中，置特定温度和时间。
具体操作：一般所需抗原包被量为每孔 20 - 200μg，每孔抗原加入 100μl，置 37℃，4h，或 4℃，24h。为避免蒸发，板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中。同时注意设置空白对照和阴性对照。
封闭酶标反应孔，加入 5% 小牛血清，置特定温度封闭一定时间，然后用洗涤液洗涤。
5% 小牛血清置 37℃封闭 40min。封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤 3 遍，每遍 3min。洗涤方法为吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置 2min 略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干。
加入待检测样品，建立合适的浓度梯度，置于特定温度和时间，用洗涤液洗涤。
检测时一般采用 1:50 - 1:400 的稀释度，应采用较大稀释体积进行，一般保证样品吸取量＞20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔 100μl，置于 37℃，40 - 60min。用洗涤液满孔洗涤 3 遍，每遍 3min。
加入酶标抗体，根据参考工作稀释度进行，置特定温度和时间，洗涤同前。
酶标抗体根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行。37℃，30 - 60min 之间。短于 30min 往往结果不稳定。每孔加 100μl。洗涤方法与前面步骤相同。
加入底物液，现用现配，置特定温度和时间，加入终止液显色。
首选 TMB - 过氧化氢尿素溶液，OPD - 过氧化氢底物液系统次之。底物加入量为每孔 100μl，置 37℃避光放置 3 - 5 分钟，加入终止液显色。
终止反应，每孔加入终止液，于一定时间内测定实验结果。
每孔加入终止液 50μl 终止反应，于 20min 内测定实验结果。
结果判断，根据特定波长读数，用酶联免疫检测仪记录数据。
OPD 显色后采用 492nm 波长，TMB 反应产物检测需要 450nm 波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值（P/N）表示，当 P/N 大于 2 时作为抗体的效价。（数值的大小依具体检测要求而定。）
五、微生物 ELISA 试剂盒检测法的注意事项
1、样本采集和处理方面
正确选择样品类型：微生物 ELISA 试剂盒检测适用于多种样品类型，如在食品中微生物检测可选择食物样品、环境表面等；在水质中微生物检测可选择自来水、废水等。需根据具体需要和实验目的进行判断。
正确采集样品：采集样品时应注意操作的无菌性，使用消毒的工具和容器，选择适当的采样方法，并将样品存放在恰当条件下，以确保样品的原始状态，避免因污染引入外源性微生物。
正确处理样品：样品采集后，需根据不同试剂盒要求进行适当处理。一般要进行稀释或浓缩，并通过超滤、离心等方法去除杂质和固体颗粒，提高检测准确性。
2、试剂和仪器使用方面
合理储存试剂：试剂的储存条件至关重要，应按照要求储存于适当的温度、湿度和光照条件下，避免因温度过高或过低、湿度变化或阳光照射等导致试剂性能下降。
正确配置试剂：试剂盒中的试剂需以适当比例配置，严格按照说明书中的方法和比例进行操作，避免配置错误导致结果错误。
正确使用仪器：使用特定仪器进行操作前，应仔细阅读操作手册，正确设置和操作仪器，确保其处于正常工作状态。
3、实验操作方面
严格遵守实验步骤：微生物 ELISA 试剂盒检测有特定操作步骤和顺序，必须严格按照试剂盒说明书进行操作，任何不按步骤的操作都可能影响结果准确性，甚至导致错误。
注意实验操作的无菌性：实验操作需保持严格无菌性，使用无菌的试剂、器具和操作台面，避免杂质干扰或外源性微生物污染。
严格控制试剂和反应时间：试剂加入量和反应时间的控制对结果准确性和可重复性至关重要，应根据试剂盒说明书要求严格控制，避免过量或不足的反应影响结果准确性。
4、结果解读方面
了解结果的含义：得到实验结果后，需根据所检测微生物的特性和试剂盒说明了解结果含义，对于阳性样品，要根据相应标准和阈值判断结果的阴性或阳性。
与其他检测方法对比：微生物 ELISA 试剂盒检测结果应与其他可靠的微生物检测方法进行对比，如传统培养方法或 PCR 方法等，以验证结果的准确性和可靠性。
六、小 结
ELISA 作为一种快速、灵敏、特异性强的检测技术，在环境微生物检测中具有广阔的应用前景。随着技术的不断发展和完善，ELISA 将在环境监测、生态风险评估、疾病预防和控制等领域发挥越来越重要的作用。派森诺竭诚为大家提供Elisa检测实验中涉及的各类试剂、耗材和设备，助力每一位生命科学实验室的科研人收获属于自己的完美实验结果，逐梦高分文章~
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