2018-01-05
2017年刚刚过去，在这一年中，派森诺生物与中科院广东微生物研究所合作开展了多项研究，已在《Frontiers in Immunology》和《Oncotarget》上相继发表研究成果。在此基础上，最新研究又以啮齿动物为模型，探索巴戟天低聚果糖对阿尔兹海默的益生元功效，并揭示菌群-肠-脑轴在此过程中的作用，研究成果顺利发表于《Frontiers in Aging Neuroscience》（最新影响因子:4.504）。
1 研究背景
肠道菌群和很多疾病相关，包括神经性疾病，例如帕金森病（PD）和阿兹海默病（AD）。AD是最常见的中枢神经系统紊乱性疾病，属于一种慢性神经退行性疾病，影响全世界超过5%的65岁以上的人口。研究表明β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的积累可能在AD的形成过程中具有重要作用。Aβ可能激活炎症和毒害神经过程，导致自由基的过剩，细胞内蛋白和其他大分子的氧化性损伤。D-半乳糖是晚期糖基化终末产物，诱导认知障碍，破坏突触沟通。
本研究将巴戟天（M. officinalis，OMO）分别应用于D-半乳糖和Aβ1-42诱导的AD-型症状的大鼠中，并检测一系列指标，包括学习记忆能力，组织免疫学指标，细胞因子水平，肠道微生物菌群以及小肠和大脑的转录表达谱，并在过量抗生素处理的三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠模型中评估益生元的功效。
2 研究方法
测序技术：Illumina MiSeq + NextSeq 500
测序模式：微生物组16S rRNA基因V3-V4区测序+转录组测序
实验设计：
1、D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的实验设计
2、Aβ1-42诱导的缺陷大鼠的实验设计
3、TNBS诱导的IBD小鼠中OMO益生元效应评估的实验设计
3 研究结果
3.1 OMO对D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的作用效果
抗氧化和神经保护作用，激活能量代谢和调节乙酰胆碱酯酶
OMO的应用可以改善D-半乳糖诱导的大鼠的学习能力和记忆功能障碍，也可以增强D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的抗氧化活性。OMO处理组和模型组相比，小肠组织的萎缩，变形和表面不均匀都有所改善。尤其在OMO-100处理组中，明显减弱了海马体结构的分解以及CA1区神经元的丢失，说明OMO的应用改善了D-半乳糖诱导的缺陷大鼠。
图1 OMO对D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的作用效果
OMO应用后肠道菌群的变化
D-半乳糖诱导组的Chao1、ACE、Shannon和npShanon等多样性指数显著降低，Simpson指数值则显著增大的（p<0.05）。尤其是在100 mg/kg/d的OMO处理后，Chao1、ACE、Shannon、npShanon和Simpson的值都趋于和正常组类似的水平。结果表明，OMO应用可以维持D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的肠道菌群的多样性水平。
图2 OMO对D-半乳糖诱导的缺陷大鼠的肠道菌群的作用效果
3.2 OMO对Aβ1-42诱导的缺陷大鼠的作用效果
OMO应用后对参数指标的改良
OMO的应用可以改善Aβ1-42诱导的大鼠的学习和记忆障碍。Aβ1-42诱导组经OMO处理后细胞因子恢复到基线水平，说明OMO的应用可以显著改善炎症水平，更可以促进一些单胺类神经递质的分泌。OMO处理组可以改善Aβ1-42诱导组引起的萎缩，变形和表面不规则等变化。模型组中的Aβ1-42和Tau细胞所占比例明显比正常组要高（p<0.05），同时OMO的应用下调了Tau蛋白的表达。
图3 OMO对Aβ1-42诱导的缺陷大鼠的作用效果
OMO明显改善了肠道菌群结构
OTU丰度及其分类学组成分析表明，Aβ1-42诱导组微生物群落的多样性降低，和Aβ1-42的剂量呈现负相关。OMO处理组和Aβ1-42诱导组结果相反，减少了促炎微生物群，富集了抗炎微生物群，表明OMO的应用可以改善肠道菌群的结构。OMO处理组中乳酸菌明显增加，这说明OMO对AD动物的肠道菌群失调可能具有类似于益生元的有益作用。
图4 OMO对Aβ1-42诱导的缺陷大鼠的肠道菌群的作用效果
3.3 OMO对TNBS诱导的IBD小鼠益生元效应研究
缓解TNBS结合抗生素引起的组织伤害和炎症
TNBS处理组的小鼠表现出腹泻，体重增加趋势下降。一些抗炎性细胞因子分泌呈现差异性，结肠组织和脾脏组织遭到严重损伤。免疫组织化学染色结果表明Foxp3，IL-17，NF-kB，TNF-α偏离了正常水平，尤其是抗生素过量处理组。OMO处理后，所有偏离的参数都回复到基准水平，尤其是OMO+双歧杆菌处理组。实验结果表明，OMO和双歧杆菌在IBD小鼠中协同发挥抗炎作用。
图5 OMO改善了高剂量抗生素和TNBS诱导的IBD小鼠的病理指标
提升双歧杆菌的移植能力
TNBS和TNBS+抗生素诱导组中，微生物菌群的多样性呈现降低趋势。而OMO可以改善这种菌群失调症状。双歧杆菌的相对丰度明显增加，其它益生菌如乳杆菌类群在整体菌群中的含量也较丰富。
图7 OMO对高剂量抗生素和TNBS诱导的IBD大鼠的肠道菌群的作用效果
3.4 Aβ水平对菌群-肠-脑轴的影响
在CA1区注射10/20 mg的Aβ1-42后，每周收集一次粪便样本，连续收集4周，并通过16S rRNA基因测序进行微生物群落分析，同时检测Aβ1-42注射后第5周的小肠和脑组织的转录表达谱。
Aβ1-42诱导的缺陷大鼠中肠道菌群动态变化和KEGG通路注释分析
大鼠肠道菌群的结构随着Aβ1-42发生变化，揭示脑中Aβ1-42水平显著影响肠道菌群的组成。优势物种的变化与乳酸杆菌科的丰度，是和Aβ1-42的剂量呈现负相关的。KEGG分析结果表明，AD型啮齿动物模型改变了氨基酸代谢、外源性物质的生物降解、核苷酸代谢等通路，这些代谢通路通过OMO的应用普遍得到改善。同时还发现，注射Aβ1-42后的第5周，海马体中Aβ1-42的水平影响了肠道菌群的代谢。
图8 Aβ1-42对大鼠肠道微生物群的作用效果
图9肠道微生物代谢系统的KEGG通路富集分析
Aβ1-42注射后缺陷大鼠小肠和脑的转录组分析
小肠转录组分析
RNA-Seq测序分析发现，308个基因在Aβ1-42-10与对照组之间差异表达，1031个基因在Aβ1-42-20与对照组之间差异表达，1059个基因在Aβ1-42-10与Aβ1-42-20之间差异表达，表明小鼠脑的Aβ1-42水平影响了小肠转录组水平。差异基因的GO富集分析结果说明肠道的炎症反应被激活，而肠道微生物变化可能影响了肠道免疫和炎症反应。KEGG富集分析结果说明脑中Aβ1-42水平可能影响了肠道的功能。
图10 小肠转录组分析
脑转录组分析
差异基因分析结果表明，Aβ1-42水平可以显著影响脑转录组。GO富集分析结果显示AD的出现依赖于Aβ1-42的积累。KEGG结果表明Aβ1-42水平会影响大脑的功能。
显著差异表达的基因之间的互作分析说明Aβ1-42水平引起了互作基因数量的增加。KEGG富集分析显示，Aβ-10注射组的差异表达基因主要富集于蛋白降解、细胞凋亡和血小板激活。以上结果可能是因为结肠细菌无法正常工作或者丢失所致，不易消化的多肽和蛋白不能发酵，短链脂肪酸如丁酸盐、丙酸盐和醋酸盐缺乏导致了血小板激活。随着Aβ1-42水平的增加，KEGG富集分析结果显示，醛固酮合成和分析、MAPK信号通路收到影响。结合肠道微生物群落多样性和肠道-脑转录组数据，发现海马体中Aβ1-42水平影响肠道微生物。
图11 脑组织转录组分析
4 总结
本文研究将OMO应用于AD病症的大鼠（D-半乳糖和Aβ1-42诱导的缺陷大鼠），验证OMO是否能通过靶向肠道菌群-肠-脑轴有效缓解AD。研究结果表明，传统药物巴戟天对各类神经疾病例如AD的作用效果，可能是由于OMO的天然化学组分调整了肠道微生态和脑生理的相互作用。
本研究亮点：
1、研究巴戟天低聚果糖（OMO）对阿尔兹海默症（AD）的作用；
2、OMO处理可缓解AD大鼠模型的学习及记忆能力障碍，改善氧化应激及炎症疾病，调节神经递质的合成与分泌；
3、OMO可缓解脑组织肿胀、神经元凋亡，并下调AD的胞内标记物（Tau蛋白及Aβ1-42）的表达；
4、OMO可维持肠道菌群的多样性及稳定性；
5、另外，OMO还可调节抗生素诱导的IBD小鼠模型的肠道菌群组成及代谢。
参考文献
Chen D, Yang X, Yang J, et al. Prebiotic Effect of Fructooligosaccharides from Morinda officinalis on Alzheimer’s Disease in Rodent Models by Targeting the Microbiota-Gut-Brain Axis[J]. Frontiers in Aging Neuroscience, 2017, 09:403.
