2025-02-05
由于下一代 RNA 测序具有高灵敏度、成本效益和通用性等优点，它在研究宿主-微生物相互作用方面一直颇受欢迎。关于宿主-微生物相互作用的分析经历了三个主要阶段（图 1）。在第一阶段，宿主细胞和细菌细胞被物理分离，然后分别对它们的转录组进行分析。第二阶段始于研究者认识到 RNA-seq 的高分辨能力和内在的单核苷酸分辨率，使其成为同时检测和定量来自不同相互作用生物体转录本的一种极其强大的技术。目前的第三阶段以越来越多地使用单细胞 RNA-seq来剖析宿主 - 微生物相互作用中的细胞异质性为标志。
图1 宿主-微生物相互作用
其中互作转录组测序（Dual RNA-seq）是2012年兴起的技术，其通过RNA-seq反映两个生物间的互作关系，是继单物种转录组后RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA领域最新的研究热点。互作转录组测序在抗病或致病机理研究、新药开发、农业病害研究和防治、物种进化和生理适应等领域具有广泛的应用前景。
互作转录组测序可以同时对互作的两个物种进行建库测序，更能反映宿主和病原体真实的表达情况。可以通过互作转录组研究宿主激活相应通路来适应和杀死细菌的机制；以及研究细菌表达某些特定基因，从而确保其在植物体内生存和复制的机制。
图2 互作转录组
一、互作转录组应用方向
医学领域
1、研究病原体致病机制：通过比较病原体感染宿主前后，双方转录组的变化，可确定病原体致病所需的分子过程，有助于开发新的药物和治疗方法，也可以预测某些疾病的发生风险。
2、探索宿主免疫应答机制：了解宿主在感染病原体后，哪些基因被激活或抑制，从而揭示宿主的免疫防御机制，为免疫治疗等提供理论依据。
农业领域
1、动植物病虫害防治：研究动植物与病原菌、害虫之间的互作转录组，挖掘动植物的抗病虫基因以及病原菌、害虫的致病、致害基因，为培育抗病虫动植物品种提供靶点，也可为开发新型生物防治手段提供理论支持。
2、生物共生关系研究：对于共生生物，如地衣中的真菌与藻类、豆科植物与根瘤菌等，互作转录组可揭示它们在共生过程中的基因表达调控，理解共生关系的建立和维持机制。
二 、互作转录组测序方案设计
互作转录组实验设计思路是互作样本中的物种与各自物种的对照样本进行差异比较。互作转录组标准的样本构成为两个物种的对照样本以及互作样本。与常规转录组不同的是互作转录组对互作样本中的两个物种同时取样、提取RNA、建库、上机测序。最后获取两个物种RNA的测序结果并分别与这两个物种的对照组进行后续转录组分析。互作样本取样部位需要精确，应同时取到互作物种；每一组样品建议至少3个生物学重复，并加大互作样本的测序量。
三、技术路线
1、常规互作转录组思路-两个物种互作
图3 思路图
①一个时间点；一种宿主；一种互作
②多个时间点；一种宿主；一种互作
doi: 10.1016/j.csbj.2021.04.008.
2、多个物种互作
③一个时间点；多种宿主；多种互作 (如植物易感、抗病)
④一个时间点；一种宿主；多种互作（如菌强致病、弱致病）
⑤多个时间点；一种宿主；多种互作
doi: 10.1371/journal.pone.0103098.
⑥多个时间点；多种宿主；多种互作
doi: 10.3390/microorganisms7090315.
代表微生物
代表宿主
四、项目文章
1、互作转录组测序助力揭示内生细菌促进寄主植物生长机制：
Endophytic Bacillus altitudinis Strain Uses Different Novelty Molecular Pathways to Enhance Plant Growth
期刊：Frontiers in Microbiology
研究背景：
植物内生细菌的鉴定和利用是可持续农业发展的重要目标。在自然界中，植物可以与多种促进植物生长的内生细菌共存，这些细菌可通过增强寄主的养分获取、固氮、获取铁和产生铁载体的能力来促进寄主生长，也有研究认为，内生细菌能产生促生长的植物激素，如IAA、ACC等。然而目前内生细菌促进寄主生长的分子机制仍无定论。
野生植物面临着复杂多变的生存环境和胁迫条件，从这类物种中分离出的内生细菌更有可能促进多种植物生长。因此，本研究旨在从野生植物中分离和鉴定内生细菌，并对其促进植物生长的特性和参与内生细菌-植物相互作用的主要分子事件进行研究。
结果：
本研究从野生植物中华甜茅中分离并鉴定了一种新的内生细菌：SB001。通过16S rDNA测序，该细菌被鉴定为高原芽孢杆菌。温室实验证明，内生菌SB001能促进不同植物的生长。转录组测序结果表明，成熟酶K、TPR样超家族蛋白、LOB结构域蛋白和BTB/POZ/TAZ结构域蛋白可能参与了内生菌SB001对拟南芥的促生作用；此外，在内生菌中发现了与植物相互作用过程中主要促进因子：MFS转运体和DNA旋转酶亚基B。这些新发现表明，内生菌SB001可作为促进植物生长的有利候选源，在可持续农业中发挥重要作用。
图4 主要结果
2、互作转录组测序助力探究宿主-寄生虫相关基因调控网络
Temporal transcriptome change of Oncomelania hupensis revealed by Schistosoma japonicum invasion
期刊：Cell & Bioscience
研究背景：
血吸虫病是全球广泛影响的人畜共患寄生虫病，湖北钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，其分布及繁殖影响疾病传播。血吸虫生活周期复杂，感染受多种因素影响，血吸虫 - 钉螺相互作用是关键研究领域。涉及寄生虫-钉螺相互作用的关键分子机制以及中间宿主感染建立过程中发生的主要分子事件目前还没有得到研究。本研究通过对感染寄生虫后第7天和第30天的钉螺进行高通量测序以探究此问题。
结果：
发现了5000多个差异表达基因，差异基因参与了生物调节和先天免疫通路相关的关键过程。使用WGCNA，识别出16个模块，一个参与RNA结合、翻译、mRNA加工和核糖体结构组成的模块与日本血吸虫的入侵密切相关。KEGG通路的许多基因参与了溶酶体、剪接体和核糖体，提示日本血吸虫入侵可能激活了血吸虫核糖体的调控和免疫应答。主要差异基因的表达模式和推测的关键调控途径将为构建宿主-寄生虫相关基因调控网络提供有用的信息。
图5 主要结果
常见问题
1、互作转录组测序是怎么做的？
互作转录组可同时提取互作样本中两个物种的RNA，构建同一个文库并上机测序。同时，分别对两物种的对照样本进行常规转录组测序。将互作样本的测序数据与互作物种的基因组比对，将比对上的部分再分别与两物种对照样本的测序数据进行生信分析，从而得到互作物种基因表达变化。
2、互作转录组文库如何构建？
（1）真核+真核互作：钓取真核生物特有polyA尾的方式，同时获得两物种的mRNA。
（2）真核+原核互作：分别剔除真核生物和原核生物的rRNA。
（3）原核+原核互作：剔除原核生物的rRNA。
3、互作转录组与常规转录组的区别？
（1）互作转录组要求取样更精确，应精准取到互作部位
（2）互作转录组建库方法根据互作物种的不同而相应变化，可能会同时剔除真核和原核生物的rRNA；常规转录组只有单一物种，分别使用真核和原核的建库方法。
（3）互作转录组因包含两个物种，需在常规转录组的基础上增大测序量，尽可能的测到互作样本中占比较小的物种。
（4）得到下机数据后，常规转录组直接与本物种的基因组进行比对；互作转录组则分别与互作物种进行比对，使用比对到相应物种的数据进行后续生信分析
4、互作转录组可以云平台交付吗？
真核有参转录组和原核转录组均可以使用云平台交付，以下是真核和原核的分析结流程：
图6 真核转录组分析流程
图7 原核转录组分析流程
