2025-03-24
Highlights
1.本文研究盐分对海洋和河滩土壤抗性组分布模式的影响。
2.了解 ARGs 区域分布模式及其影响因素，有助于评估人类接触 ARGs 的风险，高通量 qPCR极大地提高了检测效率，更加全面的评估ARGs分布模式。
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文章题目：Salinity as a predominant factor modulating the distribution patterns ofantibiotic resistance genes in ocean and river beach soils
期刊：Sci Total Environ
发表时间：2019年6月
研究背景
细菌对抗菌药物的耐药性发展是全球公共卫生和现代医学的重大挑战，抗生素等虽被视为环境中抗生素耐药基因增殖的主要压力，但无法完全解释其在自然环境中的广泛存在。细菌系统发育和重金属作用已被记载，但对其他环境因素影响土壤耐药性了解有限。海洋和河流沙滩土壤是人类活动热点，是环境和人类耐药组的重要界面，沙滩土壤高盐度会影响微生物群落结构，但缺乏盐度对土壤耐药组影响的实证，本研究通过 HT-qPCR 分析沙滩土壤样本中的抗生素耐药基因，量化土壤耐药组并确定影响其分布的因素。
研究思路
采样：所有采样地点均位于市区范围内，与人类活动密切相关。在每个地点，一个土壤样本采集0-15 cm厚的5个土芯，置于冰上运送至实验室。使用MoBio PowerSoil DNA extraction kit提取试剂盒从0.25 g土壤中提取土壤DNA。严格按照试剂盒说明书进行提取，。通过NanoDrop 2000进行检测，浓度>15 ng μl −1，A260/A280 > 1.8 and A260/230 >2.0。
土壤理化特性：检测土壤盐分，总氮和总碳等理化指标。
高通量定量PCR（HT-qPCR）分析：使用HT-qPCR分析以定量抗生素抗性基因和可移动遗传元件。296对引物，其中包括285个抗生素类的ARGs、9个MGEs（8个转座酶,1个通用的I类整合子整合酶基因 cintI-1 ）、1个临床I类整合子整合酶基因 intI-1和16S rRNA基因。使用无菌水将所有DNA样品稀释至15 ng.μl −1，并在Wafergen SmartChip实时PCR系统上对每个样品进行一式三份分析。以31为检测限，使用比较CT方法，计算ARGs和MGEs相对于16 S rRNA基因的相对丰度。
高通量测序技术研究土壤微生物以及抗生素抗性基因（ARGs）：去除低质量序列、定义 OTU、分类学分类等。对ARGs 的空间分布、相对丰度、细菌群落差异等进行分析，并探究 ARGs 与可移动遗传元件（MGEs）以及土壤性质之间的相关性。通过随机森林分析分析影响 ARGs 丰度的主要预测因子，构建结构方程模型评估环境因素和样本类型对ARGs模式的影响。
结果展示
图1：(a) 基于所有沙滩土壤样本中检测到的抗生素抗性基因（ARGs）数量，对 ARGs 进行分类，多药耐药和β-内酰胺耐药）分别占检测到的ARGs总数的32.7%和22.7%，氨基糖苷类（12.7%）、MLSB（10.9%）和四环素类（7.3%）；(b) ARGs 耐药机制，外排泵（42.7%）、抗生素失活（40.9%）和细胞保护（15.5%）；(c) 所有样本中 ARGs 和MGEs的相对丰度；(d) 每个采样点中 ARGs 和 MGEs 的相对丰度。（缩写：MLSB，大环内酯 - 林可酰胺 - 链阳菌素B耐药；FCA，氟喹诺酮、喹诺酮、氟苯尼考、氯霉素和氯霉素类抗生素抗性基因）。
图2：土壤样本中检测到的各个抗生素抗性基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）亚型的相对丰度。ARGs 亚型的类别以及核心耐药组在右侧进行了标注。所有土壤样品（热图中的列）通常分为两个主要集群，集群I包含27个海洋海滩土壤，集群II包括从海洋和河流海滩收集的34个土壤样品。
图3：(a) 与总ARGs相比，核心耐药基因组的数量和相对丰度的百分比;（b）核心耐药基因组的分类组成（仅标记每个类别中的优势ARGs亚型）。
图4：基于相关性分析的ARGs和MGEs共现模式网络，具有不同颜色的节点表示(a)不同类别的ARGs；(b)MGEs的intI1、tnpA1、tnpA2和tnpA3基因被聚为不同的模块，并与ARGs密切相关。
图5：根据Na+、Cl-浓度梯度以及电导率的盐度梯度变化，对比抗生素抗性基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）的相对丰度。随着Na+，Cl-，EC增加，ARGs和MGE的相对丰度显著增加。
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总 结
海滩土壤中 ARGs 丰富多样，是耐药性重要储存库。β-内酰胺类和多药耐药基因是主要亚型，鉴定出的核心耐药基因组含多种与临床相关基因，可能危害人类健康，其鉴定有助于预测耐药性传播。MGEs丰度高，与ARGs总量、核心耐药基因组及不同类别ARGs显著相关，表明ARGs有水平转移潜力。MGEs介导的水平基因转移可使 ARGs与细菌系统发育关系脱钩，是塑造核心耐药基因组和ARGs总量的重要因素。同时，土壤盐度相关变量是 ARGs 图谱重要预测因子，是调节ARGs分布模式最重要环境因素。盐度增加，ARGs 有上升趋势，盐度可直接促进ARGs进化流行，还可通过影响MGEs、土壤有机质溶解度、重金属迁移性、土壤pH值及细菌群落结构间接影响耐药基因组。
本研究首次深入海洋与河流海滩的土壤环境，探寻抗生素抗性基因（ARGs）的奥秘，收获了意义非凡的证据。研究发现，土壤盐度在塑造这些生态系统中耐药基因组图谱方面，扮演着至关重要的角色。诸如盐度这类环境压力，可能会增强细菌对广谱抗生素的耐药性。鉴于环境中的ARGs在盐度胁迫条件下，存在传播至人类病原体或细菌的潜在风险，此研究具有重要的公共卫生意义。深入了解维持环境抗性的环境压力，对于制定有效策略以最大程度减少ARGs 传播至关重要 。
