2025-05-08
Highlights
4种拟时序分析的差异：
monocle2：识别细胞分化路径及关键基因模块，适合简单线性或分支轨迹，计算效率高。
monocle3：基于UMAP降维的分支轨迹分析，支持非线性轨迹和大规模数据，分支分辨率更高。
Cytotrace：评估细胞分化水平，预测细胞分化的相对状态和方向，无需先验经验，适合探索性分化研究。
RNA velocity：结合剪接动力学预测细胞未来状态，揭示细胞命运的时间箭头。
拟时序分析可用于理解细胞在不同功能状态之间的转变，预测细胞的分化及发育轨迹，根据轨迹分布和特征基因的表达变化来确认分化起点和终点。
拟时序分析的各类软件之间有什么区别，适合什么场景呢？下面我们来详细解释。monocle2和monocle3是最常用的两种方法，因此详细介绍。
一、monocle2
原理：类似机器学习的方法，根据输入数据的特征基因构建轨迹树，细胞在树中的路径反映分化过程。之后优化细胞在低维空间中的位置，同时考虑细胞间的相似性，形成分化的轨迹,筛选随时间变化的基因模块，帮助识别驱动分化的基因。
输入文件：RDS
分析流程：
1. 用带有注释信息的RDS，构建CellDataSet（CDS）对象。
2. 提取用于分析的基因：
基于monocle的dispersionTable选择高可变基因：默认筛选条件为平均表达量>0.1。
另外还有基于differentialGeneTest的方法、基于seurat选择高变基因的方法以及基于seurat中FindAllMarkers方法，可以根据需求自行选择。
3.降维：
reduceDimension函数利用DDRTree降维算法将高维的单细胞基因表达数据映射到低维空间，便于推断细胞的发育轨迹或分化路径。
4.计算细胞拟时间
orderCells函数用于构建细胞轨迹的线性或分支结构、生成伪时间等，默认根是State 1（“State”是Monocle用来表示轨迹树分支的术语），可以使用root_state 指定根节点。
5.轨迹图展示
参数color_by 用于指定根据哪个变量（如细胞类型、伪时间、状态等）对细胞进行着色。
6.基因可视化
plot_genes_in_pseudotime函数用于分支分析中基因表达的可视化，展示基因在分支点的表达差异
输出结果：
应用场景：
发育生物学：研究胚胎或器官发育中的细胞命运决定（如造血系统分化）
疾病机制：解析肿瘤演进轨迹，识别恶性转化中的关键基因
二、Monocle3
原理：用UMAP将细胞投影到低维空间，然后采用分区图抽象的方法，构建一个最近邻图，通过寻找图中的最长路径来识别分化轨迹。
输入文件：RDS
分析流程：
1. 用带有注释信息的RDS，构建CDS对象。
2. 降维，导入umap坐标，聚类分群
reduceDimension函数使用 PCA 对高维数据进行预处理，之后使用UMAP进行降维聚类分群。然后从RDS里导入umap坐标，使monocle3的结果与之前大类注释的结果一致。
3. 轨迹推断与细胞排序
learn_graph函数根据降维后的数据，学习细胞之间的邻接关系，并构建graph，反映细胞在发育或分化过程中的潜在路径。root_cells指定根节点
4. 拟时轨迹差异分析
（1）寻找拟时轨迹差异基因
graph_test函数用于识别沿细胞发育轨迹变化的基因，并通过计算莫兰指数来评估这些基因在细胞群体中的空间自相关性。
莫兰指数（morans_I），值在-1至1之间，0代表此基因没有空间共表达效应，1代表此基因在空间距离相近的细胞中表达值高度相似。
（2）挑选top基因画图展示
Trace_genes_sig函数筛选出空间自相关性（由莫兰指数衡量）最强的前10个基因，进行后续的分析或可视化。
（3）绘制基因表达趋势图
plot_genes_in_pseudotime函数用于分支分析中基因表达的可视化，展示基因在分支点的表达差异，筛选表达量大于0.5的基因。
（4）寻找共表达模块
find_gene_modules()、aggregate_gene_expression()等函数从基因表达数据中提取特定基因、进行模块检测、按细胞组聚合基因表达数据并最终生成热图以可视化基因表达模式
输出结果：
应用场景：
复杂系统分化：研究具有多分支路径的细胞命运选择
大规模数据：处理大样本量数据
与monocle2相比，monocle3的优势：
从UMAP图识别发育轨迹，可以继承Seurat的质控、批次校正和降维分析结果，实现“一张图”展现细胞的聚类、鉴定和轨迹分析结果。自动对UMAP图分区（partition），可以选择多个起点，轨迹分析算法的逻辑更符合生物学现实。
三、Cytotrace
原理：
通过量化基因表达的随机波动来推断细胞的分化状态，其核心假设是：未分化的干细胞或祖细胞具有更高的表达噪声，以维持其多潜能性；而分化细胞因功能特化，表达模式更稳定。
输出结果：
四、RNA velocity
原理：
通过量化每个细胞中未剪切mrna和剪切mRNA的丰度，推测基因转录速率和斜率参数，因此Velocity可在不知发育过程的前提下，预测谱系的方向。
输出结果：
应用场景：
动态过程解析：研究组织中的细胞迁移方向
轨迹验证：为Monocle推断的轨迹提供方向性证据
瞬时状态捕捉：分析稳态组织中缓慢变化的细胞过程
