2025-06-23
文章题目：Wastewater-based analysis of antimicrobial resistance at UK airports: Evaluating the potential opportunities and challenges
期刊：Environment International
发表时间：2025年1月
研究背景
抗菌素耐药性（AMR）是重大全球公共卫生威胁，其细菌分布、丰度和多样性在地理区域之间存在显著差异，受到健康、社会经济和环境等一系列因素的影响，跨境旅行加速了 AMR 细菌全球传播，因此，迫切需要全面了解AMR病原体全球分布和国际传播的动力学。人类废水是 ARG 传播的环境库，不过各国 AMR 监测存在差异，实施有效全球监测有挑战。机场作为微生物群落聚集枢纽，基于废水的流行病学为全球 AMR 监测提供新方法。2024 年全球航空旅行或对 AMR 传播贡献重大，此前研究表明旅行者携带耐药细菌风险高，对飞机废水的研究显示其可反映不同地区 ARG 情况，还可能是 “外源性” AMR 细菌进入当地水循环的途径。目前对飞机废水的研究处于起步阶段，本研究旨在评估其在全球 AMR 监测中的效用，在英国三个国际机场多点采样，用高通量 qPCR 和宏基因组测序分析，这种双重方法既提供了已知抗性基因的靶向定量，又提供了对整个抗性组组成的更广泛视角。
研究思路
采样地点
在新冠肺炎大流行期间，对英国布里斯托尔机场、爱丁堡机场和伦敦希思罗机场的废水进行取样。研究期间，乘客入境英国不受限制，无论是否接种疫苗，未接种疫苗旅客抵达时也无需检测或隔离。现场废水取样由外部合作者与当地机场工作人员协调进行，希思罗机场、布里斯托尔机场、爱丁堡机场有限公司等三家机场公司授予采样授权。
样品采集和理化分析
2022 年 3 月 8 日至 31 日，从英国布里斯托尔、爱丁堡和伦敦希思罗机场共收集 158 个样本，同时测量废水电导率、pH 值、浊度、铵和正磷酸盐浓度。
布里斯托尔机场：从到达航站楼下水道检修口（BRS-A）、机场整体下水道检修口（BRS-WA）及入境飞机服务的真空卡车存放地检修口（BRS-IA）取样，自动取样器在每次废水排放事件采集单个样本，每个样本为 4-7 个入境航班废水混合物；
爱丁堡机场：从国际航站楼下水道检修口（EDI-T）、真空卡车存放地泵站（PS）及机场污水处理厂取样；
伦敦希思罗机场：从中央航站区下水道检修口（LHR-CT）及采样当天收集 10 架飞机废水的真空卡车（LHA-IA）取样。
废水DNA提取
废水样本在收集后储存在-80℃下，提取时解冻。使用改良的FastDNA™SPIN土壤试剂盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）从颗粒中提取DNA。然后将100μl DNA提取物储存在-20℃下，备用。
高通量qPCR
HT qPCR检测共使用了96组引物，靶向ARG（76个基因）、移动遗传元件（MGE，10个基因）、病原体（5个基因）和5个其他基因，包括那些重金属抗性的基因和用于标准化的16S rRNA基因。这些靶点是根据威尔士公共卫生部专业抗菌化疗部门的建议选择的，包括广泛的临床相关ARG。将DNA提取物使用SmartChip™实时PCR系统进行基因定量。
宏基因组文库的构建和测序
对来自LHR-IA、LHR-CT和BRS-IA的30个废水样本的子集（表1）进行了宏基因组分析。
表1：布里斯托尔（BRS）、爱丁堡（EDI）和伦敦希思罗（LHR）机场废水取样情况。
序列数据的生物信息学分析
统计分析
研究结果展示
ARG的相对丰度
对于每个样本中的16S rRNA基因， 通过HT-qPCR技术对样本中ARG丰度定量发现（图1.A）：
机场间差异：布里斯托尔机场（BRS）ARG平均总相对丰度显著高于爱丁堡（EDI）和伦敦希思罗机场（LHR）（单因素方差分析，p<0.01）。
样本类型差异：希思罗机场飞机废水样本（LHR-IA）ARG相对丰度显著高于航站楼样本（Welch t检验，p<0.05），布里斯托尔机场不同来源样本无显著差异；爱丁堡污水处理厂ARG相对丰度显著低于机场样本（Welch t检验，p<0.05）。
HT-qPCR分析
航站楼废水：大环内酯类、林可酰胺类和链菌素（MLS）抗性基因丰度高（图1.B）（与爱丁堡污水处理厂水平相近），布里斯托尔机场不同航站楼样本中，ermB（BRS-WA）和 mrsE（BRS-A）基因丰度差异显著（Welch t 检验，p<0.01）。
飞机废水：布里斯托尔和希思罗机场飞机废水样本中四环素抗性基因 tetM 丰度显著高于航站楼（Welch t 检验，p<0.01），MLS 抗性基因丰度更低（Welch t 检验，p<0.01）；爱丁堡机场样本（EDI-PS）未呈现类似差异，其 qacF 基因（编码多药外排泵）丰度相对较高。
图1. （A） 显示相对于16S rRNA基因的ARG总丰度的箱形图。（B） 堆叠条形图显示了飞机和机场相关废水样本中HT-qPCR靶抗菌药物耐药基因（ARG）的相对丰度。除入境飞机外，相对丰度是每个废水源所有样本的平均值。
宏基因组分析结果
数据特征：样本平均输出 204122个reads，86% 具有抗微生物能力；希思罗航站楼样本（LHR-CT）ARG 曲线与 HT-qPCR 结果一致，飞机样本（LHR-IA）抗性谱差异较大。
基因聚类与差异表达：分层聚类显示 LHR-CT 和 LHR-IA 抗性体形成不同簇，ALDEx2 分析证实 mefA 和 tet16A 在航站楼样本中更丰富，tetM 和 ermT 在飞机废水样本中更高；飞机样本抗性簇与地理无强关联（图2）。
副抗性组差异：LHR-CT 样本中附件抵抗体占比（19±6.0%）显著高于 LHR-IA（11±3.7%，Welch t 检验，p<0.01），LHR-IA 样本中苯尼考抗性基因相对丰度极高。
图2. 集群抗性组热图显示了宏基因组废水样本子集中50个最丰富的抗菌药物抗性基因（ARG）的对数转换丰度。
ARG的Alpha多样性
HT-qPCR 检测覆盖度：
在废水抗性体中平均检测到 79 个靶 ARG 中的 66 个，仅 blaOXA-23 和 VEB 在所有样本中均未检出。
宏基因组分析的 ARG 数量与多样性：
飞机样本对比：伦敦希思罗机场飞机废水（LHR-IA）中检测到的 ARG 数量显著高于布里斯托尔机场飞机废水（BRS-IA）（Welch's t 检验，p<0.01），但两者的 Shannon 多样性指数无显著差异（p=0.1979）。
地区航班差异：来自非洲和亚洲的航班携带的 ARG 数量高于北美和欧洲航班，其中亚洲与欧洲航班的差异显著（Welch t 检验，p<0.01）（图3）。
航站楼样本（LHR-CT）与飞机样本（LHR-IA）的 ARG 多样性（观察指数和 Shannon 指数）无显著差异（p=0.8306 和 0.7785），但 LHR-IA 中独特 ARG 总数更高（202 个 vs. LHR-CT 的 182 个）。
图3. 全球区域对入境飞机废水宏基因组分析中发现的抗菌药物耐药基因（ARG）总数的影响。
ARG的Beta多样性
不同机场废水抗性体聚类特征：
布里斯托尔与伦敦机场：废水抗性体按来源呈现显著聚集（PERMANOVA，p<0.01），其中伦敦样本经宏基因组分析也显示按来源聚类明确（图4.A、C）。
布里斯托尔机场：与航站楼样本（BRS-A、BRS-WA）相比，飞机废水样本（BRS-IA）的抗性组异质性更高（图4.A）。
爱丁堡机场：废水抗性体未观察到明显的来源聚类（PERMANOVA，p>0.05）（图 4.B），其泵站样本（EDI-PS）抗性特征与布里斯托尔、伦敦的飞机废水差异显著（p>0.01）。
跨机场对比：
1.航站楼来源的废水抗性体均按来源显著聚集（PERMANOVA，p<0.01）。
2.伦敦与布里斯托尔的飞机废水抗性体未按来源聚类（PERMANOVA，p=0.06），且与爱丁堡泵站样本的抗性特征无显著关联。
图4. 基于Hellinger转换的ARG相对丰度的Bray-Curtis相异矩阵的PcoA排序图，显示了（A）布里斯托尔、（B）爱丁堡和（C）伦敦希思罗国际机场废水样本之间的抗菌药物抗性基因（ARG）组成差异。
ARGs与潜在影响因素的相关性
整体说明作用：基于距离的冗余分析（RDA）显示，废水物理化学性质对废水抗性体组成具有显著总体说明作用（调整后R²=0.38，p<0.01）（图5），其中铵浓度影响最大。
不同机场铵含量差异显著：爱丁堡机场样本（如EDI-T）铵含量最低（44.7 mg N·L⁻¹），伦敦希思罗航站楼（LHR-CT）和布里斯托尔机场到达航站楼（BRS-A）样本铵含量最高（分别为127.9 mg N·L⁻¹和122.3 mg N·L⁻¹）。
样本来源间的变量差异：希思罗机场飞机废水样本（LHR-IA）的 pH 值、电导率、正磷酸盐浓度和浊度显著高于航站楼样本（LHR-CT）（Welch t 检验，所有比较p<0.01），显示不同来源样本的理化性质存在明显区分。
ARGs基因与理化性质、可移动遗传元件和HT-qPCR目标病原体的关联
整合酶基因相关性：整合酶基因intI3和intI1与抗生素抗性基因（ARGs）存在强显著正相关（ρ>0.7，p<0.01），表明可移动遗传元件对 ARG 传播可能有重要影响。
病原体与理化性质关联弱：ARGs 与病原体或其他理化性质（除铵浓度外）的直接关联较弱，未发现显著强相关性（图 S6）。
图5. 基于距离的冗余分析（dbRDA）显示了环境变量对机场相关废水样本中抗菌药物耐药基因（ARG）谱的影响。
微生物群落与病原分析
微生物群落组成与多样性
分类与优势菌群：
宏基因组 Kraken 分析显示，每个样本平均输出39990814个分类单元，96% 归类为细菌。在LHR样本之间的微生物群落多样性方面没有观察到显著差异（观察到：p=0.5，Shannon-p=0.5），所有样本均以厚壁菌门为主（主要属于肠球菌科）（图6.A）。希思罗机场（LHR）样本的微生物群落组成按来源显著聚集（PERMANOVA p<0.01）（图6.B），航站楼废水（LHR-CT）中变形杆菌门更丰富，这是由于 Comamonadaceae 科及低丰度家族丰度明显更高（Welch t 检验，p<0.01）。
图6.（A） 堆叠条形图显示了宏基因组废水样本子集（B）中分类群的相对丰度。基于Hellinger转换的分类群相对丰度，Bray-Curtis相异性矩阵的PcoA排序图显示了伦敦希思罗废水样本之间的分类组成差异。
机会病原体检测结果
检出率与分布差异：金黄色葡萄球菌在所有样本中均未检出，其余四种目标病原体（鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肠球菌）均有检出，其中鲍曼不动杆菌检出率最高（141/180）。
机场间差异：鲍曼不动杆菌在布里斯托尔机场（BRS）样本中相对丰度最高，肺炎克雷伯菌在希思罗机场（LHR）样本中最高（单因素方差分析均p<0.01）。铜绿假单胞菌丰度在机场航站楼间无显著差异（单因素方差分析p=0.06，f=2.794；图7）），但在飞机样本中显著高于航站楼（Welch t 检验，p<0.05），肠球菌仅在EDI样本中检测到。
样本类型差异：鲍曼不动杆菌在机场（航站楼 、污水处理厂）废水中的相对丰度显著高于飞机样本（Welch t 检验，p<0.05）。肠球菌仅在爱丁堡机场（EDI）样本中检测到，且在泵站样本（EDI-PS）中的丰度显著低于国际航站楼（EDI-T）和污水处理厂（EDI-WWTP）样本（单因素方差分析p<0.01，f=9.122）。
图7. 箱形图显示了飞机和机场相关废水样本中HT-qPCR靶病原体的相对丰度。
潜在ARG主机的网络分析
基于强（ρ>0.7）和显著（p<0.01）相关性）网络分析，探讨了40个最丰富的ARG和细菌属之间的共现模式（图8）。甲氧苄啶ARG、dfrF和几种四环素ARG-tetW、tetO和tet40-与多种细菌属相关，包括共生肠道菌群，如粪杆菌、Dorea和Ruminococcus。多个分类群与编码对不同类别（如sul1、catB、ermT、tetG和flor）的各种抗菌药物的耐药性的高度丰富的ARG相关，其中葡萄球菌的数量最多。
图8. 网络分析显示了飞机废水样本宏基因组亚群中40个最丰富的抗菌药物耐药基因（ARG）与细菌属之间的关系。连接表示强而显著的相关性（斯皮尔曼相关系数ρ>0.7，p<0.01）。
总 结
本研究首次全面同时调查了多个国际机场飞机和航站楼废水中AMR的丰度和多样性。研究结果表明，飞机乘客废水可能在将来自全球不同人群的AMR细菌迅速引入当地水循环中发挥作用。飞机废水监测为全球 AMR 防控提供了独特的跨区域视角，但其应用需突破样本偏差、技术标准化及伦理治理等多重挑战。未来需通过多学科协作，构建兼顾科学性与伦理合规性的监测体系，为应对抗生素耐药性危机提供创新解决方案。
