2025-06-26
Highlights
1、WB 实验样本制备的关键在于根据目标蛋白特性选择合适裂解液（如 RIPA、NP-40 或含强去垢剂的裂解液）
2、组织和细胞样本处理需遵循速冻研磨、清洗刮取等细节，蛋白定量采用 BCA 法，变性时需煮沸并离心确保上样质量
3、特殊蛋白（膜蛋白、磷酸化蛋白等）制备需针对性优化步骤，如使用强去垢剂、升级抑制剂或分步提取，全程把控低温与操作精度
还在为WB条带上的杂带、模糊或空白而抓狂？问题往往就出在第一步—— 样本制备！一份高质量的蛋白样品是WB成功的基石。今天就来手把手教你如何避坑，轻松搞定WB样本制备！
一、WB裂解液的选择及操作：你的“破壁”利器
选择合适的裂解液，是提取目标蛋白的关键第一步。常见的裂解液“三剑客”：
1、RIPA裂解液
组成：强效去垢剂（Triton X-100、脱氧胆酸钠、SDS等）、盐、缓冲液。
特点：裂解能力强，适用于大部分胞浆蛋白、核蛋白及部分膜蛋白。
适用：总蛋白提取（尤其适合溶解度较高的蛋白）。
注意：可能破坏蛋白间互作，强SDS可能干扰后续Bradford定量。
2、NP-40裂解液
组成：温和非离子去垢剂NP-40、盐、缓冲液。
特点：裂解能力温和，能保持蛋白天然构象和相互作用。
适用：胞浆蛋白、弱结合膜蛋白、需保持活性的蛋白（如激酶活性检测）、免疫共沉淀（Co-IP）样本制备。
注意：对核蛋白和跨膜蛋白提取效率较低。
3、含强去垢剂裂解液（如含SDS/尿素/硫脲）
组成：含SDS、尿素、硫脲等强变性剂。
特点：裂解能力极强，能溶解难溶蛋白（如包涵体、高度疏水蛋白）。
适用：膜蛋白、核基质蛋白、沉淀或聚集的蛋白。
注意：强烈变性，破坏蛋白结构和相互作用，不适用于活性分析或Co-IP。
操作关键：
现用现配：裂解液最好新鲜配制，或在4℃短期保存。
冰上操作：全程低温（冰浴）操作，抑制蛋白酶活性。
添加抑制剂：蛋白酶抑制剂（如PMSF, Cocktail）和磷酸酶抑制剂（如NaF, Na3VO4, Cocktail）是必需品，根据样本类型和目标蛋白添加。
裂解体积：根据样本量调整，组织通常按重量（mg）:体积（μl）=1:5-10；细胞按数量（10⁶）:体积（μl）=1:50-100。
二、蛋白样品制备关键点：细节决定成败
无论组织还是细胞样本，这些核心环节必须掌握：
1、组织样本
取材速冻：离体后迅速用液氮或干冰速冻，-80℃保存。
低温研磨：在液氮预冷的研钵中快速研磨成细粉，或使用组织匀浆器（全程低温）。
快速转移：研磨后立即加入预冷的裂解液。
2、细胞样本
彻底清洗：用预冷的PBS轻柔洗涤细胞2-3次，去除培养基杂质（尤其是血清蛋白）。
轻柔刮取/消化：推荐用细胞刮刀在冰上刮取（避免胰酶消化引入酶活性和改变蛋白状态）。如需胰酶消化，立即用含血清培养基中和并充分洗涤。
直接裂解：在培养皿/瓶中加入裂解液，冰上裂解。
3、蛋白定量
必须做！确保上样量一致是结果可比性的基础。
推荐BCA法：受去垢剂和还原剂影响较小，准确性高。
标曲准确：使用与待测样品裂解液成分一致的BSA标准品制作标准曲线。
稀释样品：确保样品吸光度值落在标准曲线线性范围内。
4、蛋白变性
加Loading Buffer：定量后，按比例加入含SDS和还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）的蛋白上样缓冲液。
煮沸：95-100℃加热5-10分钟，彻底变性蛋白，打开二硫键。
短暂离心：煮沸后稍离心，收集管壁液滴。
三、特殊蛋白样品制备技巧：挑战高难度
膜蛋白/跨膜蛋白：
裂解液选择：必须使用强效裂解液（含高比例去垢剂如SDS、Triton X-114，或尿素/硫脲）。
增加去垢剂浓度：在RIPA或NP-40基础上，可额外添加CHAPS、Digitonin等。
延长裂解时间/辅助手段：裂解时可配合超声破碎（冰浴，短时多次），或4℃旋转裂解过夜。
磷酸化蛋白：
抑制剂升级：使用强效、广谱的磷酸酶抑制剂Cocktail 。
快速处理：样本处理速度要快，避免磷酸酶去磷酸化。
低温贯穿始终：从取材到裂解全程严格低温。
避免反复冻融：分装保存样品，避免反复冻融导致磷酸化状态改变。
核蛋白：
分步提取：先裂解胞浆（用较温和裂解液如含NP-40的低渗缓冲液），离心弃上清（胞浆），再裂解沉淀的细胞核（用强效裂解液如含SDS的RIPA或高盐缓冲液）。
核酸酶处理：裂解核组分后，可加入适量核酸酶（如Benzonase）降解核酸，减少粘稠度。
低丰度蛋白：
增加上样量：前提是裂解液体积允许且背景可控。
样品浓缩：使用超滤离心管、TCA/丙酮沉淀法浓缩蛋白（注意沉淀可能导致部分蛋白损失或难溶）。
减少杂质：优化裂解和离心步骤，尽可能去除无关杂蛋白。
四、总结
WB样本制备绝非简单的“研磨-裂解-煮沸”，它是 精细度、标准化和耐心 的结合。深刻理解目标蛋白的特性，选择匹配的裂解液，严格控制操作条件（低温、快速、抑制剂），精确进行蛋白定量和变性，才能为后续的WB实验铺平道路。每一次成功的Western Blot，都始于一份完美的样本！派森诺竭诚为大家提供WB样本提取过程中所涉及的试剂耗材，助力每一位生命科学实验室的科研人收获属于自己的完美实验结果，逐梦高分文章~
