2025-06-30
BSA测序相关的多组学联合分析再添高分文章啦~
近日，上海交通大学联合国际科学家在《Plant Biotechnology Journal》发表新研究成果！首次揭示镁螯合酶H亚基（ChlH/GUN5）通过质体逆行信号调控番茄果实成熟的全新机制。该研究不仅拓展了对植物发育调控的认知，还为果蔬保鲜和品质改良提供了关键靶点。
本研究的测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
叶绿体作为环境感受器，通过逆行信号机制调控核基因表达。该机制通过四吡咯生物合成（TPB）、质体氧化还原状态等多条途径传递质体代谢信息。利用类胡萝卜素抑制剂Norflurazon（Nf）筛选发现，拟南芥中六个GUN基因参与TPB途径：GUN1编码叶绿体PPR蛋白，GUN5编码镁螯合酶H亚基。这些基因除调控逆行信号外，还影响叶绿素合成，但其在作物生殖发育中的功能尚不清楚。
番茄是研究果实成熟的理想材料，作为呼吸跃变型果实，成熟伴随乙烯合成和呼吸增强，其中乙烯信号缺陷会显著延缓成熟。成熟过程涉及叶绿体向有色体转化，需要核质双向通讯。研究发现番茄质体泛素连接酶SlSP1通过调控蛋白稳态影响成熟，暗示逆行信号可能参与成熟调控。
通过EMS诱变获得SlChlH错义突变体mut26。该突变体表现出典型gun表型，且果实成熟延迟、乙烯合成减少、质体转化受阻。遗传互补实验证实这些表型由SlChlH突变引起，说明GUN5介导的逆行信号促进番茄果实成熟。
研究材料与方法
1、实验材料
EMS诱变AC番茄获得mut26突变体，mut26×LA1589构建F2分离群体，从中选取野生和突变各30株进行混池构建，与亲本“mut26”和LA1589进行测序。
2、实验材料
Illumina
3、分析内容
Mutmap、RNAseq、蛋白质分析、生理指标测定、显微观察等技术多维度验证基因功能。
研究结果
BSA：叶绿素缺陷型番茄突变体的分离与定位
通过EMS诱变获得的番茄突变体mut26（Ailsa Craig背景）表现出叶片黄化表型（图1a）,且其叶绿体发育明显受阻（图1b、1c、1d）。选择mut26×LA1589的F2群体进行BSA定位，定位到chr.4上的三个区域（超过99%置信阈值）：4.9-8.6 Mb、9.1-51.5 Mb和52-56 Mb（图1e）。对野生型AC测序分析，候选区域内仅SL2.50ch04_6038590位点位于编码区。该SNP位于SlChlH基因（Solyc04g015750），导致Pro398→Ser错义突变（图1f）。利用AC×mut26和mut26×LA1589两个F2群体进行CAPS验证，证实SlChlH突变是导致mut26表型的原因。
图1 叶绿素缺陷型番茄突变体mut26的遗传定位
mut26是一个gun突变体
施加类胡萝卜素抑制剂Nf后，mut26中多个SlPhANG表达受抑制程度较轻，表明其具有GUN表型（图 2a）。根据拟南芥的命名规则，mut26是番茄中的gun5突变体，且SlPhANGs的表达模式表明它是一个弱GUN突变体。
利用CRISPR-Cas9技术获得了两个纯合突变株系——一个在SlChlH第一外显子存在2-bp 缺失，另一个存在1-bp 插入。这两株突变体均表现出强烈的白化苗表型（图 2b）。
出乎意料的是，mut26中SlChlH 蛋白的水平较WT显著升高，而其转录水平仍与 WT 相当（图 2c,d）。综上，这些结果表明，SlChlH突变是导致mut26兼具GUN 表型和叶绿素缺陷表型的原因。
图2 mut26是一种番茄gun突变体
四吡咯合成在 mut26 突变体中减弱
通过HPLC检测了mut26中四吡咯中间产物的含量。结果显示：mut26叶片中的总叶绿素含量仅为野生型的约43%（图3a），而5-氨基乙酰丙酸（ALA）的合成速率约为野生型的47%（图3b），这可能是由于叶绿素含量降低引起的反馈调节所致。
与野生型和互补株系相比，mut26中所有四吡咯中间产物的稳态水平均有所降低（图3c）。虽然预期会因催化底物转化受阻而导致原卟啉IX积累，但mut26中的Proto IX含量与野生型相当（图3d）。这一结果与烟草研究结果一致。相比之下，mut26中非共价结合血红素的积累速率没有明显变化（图3e）。目前尚不清楚SlChlH突变如何影响TPB途径中其他蛋白的积累。
图3 mut26突变体中四吡咯合成减少
mut26果实成熟过程出现延迟
SlChlH转录水平在花后35天（dpa）开始上升，41 dpa达到峰值后下降（图4a）。在此期间，SlChlH蛋白水平与转录水平变化趋势一致（图4b）。这一表达模式促使我们探究SlChlH是否直接调控果实成熟。破色期（BR）起始被视为番茄果实成熟的标志。mut26果实发育至MG期与WT基本一致，但后续成熟过程较WT延迟约3天（图4c）。
果实乙烯释放表明mut26仅在同期呈现中度增加，峰值延迟至41 dpa，互补株系#6的乙烯释放早于WT（图4d），与其早熟表型一致，表明SlChlH并非果实成熟的必需因子。
UPLC分析显示，44 dpa时mut26的β-胡萝卜素和番茄红素含量显著低于WT，互补株系#6中恢复至WT水平（图4e）。TEM观察发现：mut26的叶绿体发育较WT迟缓。质体小球（PGs）数量在mut26中显著减少（图4g）。
图4 mut26突变体表现出乙烯释放量降低和果实成熟延迟的表型
质体逆行信号与成熟相关基因表达在mut26中受损
比较35 dpa（MG期）和38 dpa的转录组，发现WT中鉴定到4012个差异表达基因（DEGs，1388上调/2624下调），而mut26仅1897个（882上调/1015下调）（图5a）。19个推定SlPhANGs中，17个被RNA-seq检测到（图5b）。除SlCBP2和SlRBCS3B在两者中均被抑制外，其余15个SlPhANGs在WT中被抑制而在mut26中仅部分抑制。RT-qPCR证实SlCAB1B、SlCAB1C和SlRBCS1在WT中35-38 dpa被显著抑制，而mut26抑制程度较轻（图5c）。乙烯合成通路和信号通路关键基因在WT成熟期被诱导，而mut26中诱导受损（图5d）。类胡萝卜素合成和细胞壁降解相关基因的诱导表达在mut26中同样受阻（图5d）。
关键转录因子分析显示：TAGL1、FUL1和AP2a以GUN5依赖方式被诱导（图5d），这些结果表明SlChlH(GUN5)通过调控RIN等转录因子及乙烯合成、类胡萝卜素积累和细胞壁降解相关基因来促进果实成熟。
图5 果实成熟期间mut26突变体内多个成熟相关基因及逆行信号靶基因的异常表达
SlHY5在GUN5下游调控质体逆行信号传导
已有研究表明，拟南芥中HY5蛋白参与GUN5介导的逆行信号通路，通过构建mut26 Slhy5双突，分析SlHY5对GUN5介导的质体逆行信号通路的影响。
室温培养时，双突与Slhy5单突一样，在幼苗早期表现出下胚轴伸长但无白化表型，但生长后期，无论在室内常温还是室外低温，mut26 Slhy5都表现出严重白化表型（图6a）。
检测Nf处理的5日龄幼苗中SlPhANGs的表达显示：Slhy5单突未表现明显gun表型；mut26的gun表型在双突中被抑制（图6b-d）。这些数据表明，在幼苗期SlHY5位于GUN5介导的质体逆行信号通路下游，对SlPhANGs表达起促进作用，该作用受GUN5抑制。
图6质体逆行信号通路中SlHY5作用于GUN5下游，促进SlPhANGs基因的表达
Slhy5单突变体中逆行信号未受影响
先前研究发现Slhy5敲除突变体表现果实着色延迟的异常成熟表型。本文通过直接标记MG、BR、BR+3和BR+6等成熟阶段的果实发现：Slhy5从MG到BR+6阶段的果实着色速率较WT减慢（图7a）；BR+6阶段β-胡萝卜素和番茄红素含量低于WT（图7b）。但Slhy5在MG和BR阶段的乙烯释放量与WT相当（图7c），成熟相关基因（ACS2、ACO1、PSY1、RIN、TAGL1和FUL1）表达与WT无差异（图7d）。因此得出结论：除影响果实着色外，SlHY5不调控乙烯合成或成熟进程。
图7除了在MG到BR阶段加速果实色素沉着外，SlHY5对果实成熟进程没有其他影响
结 论
研究团队通过化学诱变技术，意外获得了一种"慢性子"番茄突变体mut26。这种番茄的成熟速度比普通品种慢了整整3天，乙烯释放量减少，果肉更紧实，类胡萝卜素积累延迟——简单来说，它就像被按下了"减速键"，意义重大：
1、破解"成熟密码"：过去认为乙烯是果实成熟的唯一开关，但研究发现，叶绿体发出的信号同样至关重要。SlChlH如同一个"指挥官"，协调叶绿体退化与核基因表达，确保成熟过程精准有序。
2、抗衰老番茄的潜力：通过调控SlChlH，未来可培育耐储存、慢成熟的番茄品种，减少运输损耗，甚至让番茄在货架上多保鲜数天！
3、农业应用前景广阔：该机制可能适用于其他茄科作物（如辣椒、茄子），为农产品保鲜和品质改良提供新思路。
文章索引：Dawei Xu.,Li Lin.,Xiaorui Liu., et al.Characterization of a tomato chlh mis-sense mutant reveals a new function of ChlH in fruit ripening.Plant Biotechnol J.2025 Mar;23(3):911-926.doi: 10.1111/pbi.14548.Epub 2024 Dec 19
