2025-06-30
骨髓（BM）来源的间充质基质/干细胞（MSCs），具有非造血、可塑性粘附和集落形成细胞的特性。越来越多的证据表明，MSCs具有三系分化潜能，并且是骨髓中造血干细胞（HSC）生态位的重要组成部分。然而，由于技术和材料的限制，关于人类骨髓间充质细胞的细胞生物学知之甚少。本研究从6到24周发育阶段的人类胚胎中分离出原代BMNCs，进行scRNA-seq分析，通过系统性的生物信息学分析和实验验证，我们确定了人类骨髓中的两种干细胞类型。
英文标题：Characterization of mesenchymal stem cells in human fetal bone marrow by single-cell transcriptomic and functional analysis
中文题目：单细胞转录组学和功能分析对人胎儿骨髓间充质干细胞的表征
期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影响因子：40.8
发表时间：2023-05-31
DOI号：10.1038/s41392-023-01338-2
样本：6至24周发育阶段的人胎儿胚胎长骨中冲洗骨髓中的细胞
研究方法
第1次单细胞测序：
两个20周和21周的胚胎长骨中冲洗骨髓中的细胞，识别了人胎儿骨髓中的多种细胞类型
第2次单细胞测序：
9个11至22周胚胎的骨髓细胞分选非造血细胞，发现了四个具有成骨细胞（OB）谱系发育轨迹的集群，一个软骨细胞群、一个循环间充质细胞群和一个间充质祖细胞群（MPC）。
第3次单细胞测序：
17个6至24周胚胎的骨髓细胞，随机挑选细胞进行测序，识别了内皮细胞、间充质细胞和造血细胞。将间充质细胞分为7个集群，包括间充质祖细胞、循环祖细胞、成骨-软骨祖细胞、软骨细胞祖细胞等。鉴定了早期发育阶段间充质细胞中可能起重要作用的转录因子。
结合数据进行后续分析
结合了第二次和第三次测序的数据，揭示了不同发育阶段BMSCs的独特表达模式。确定了MSCs的两个主要亚群：MSCs（C01.MSC）和CXCL12+MSCs（C02.CXCL12），并通过体内移植实验验证了它们的成骨能力和造血微环境重建能力。
第4次单细胞测序：
从15周和17周胚胎骨髓中分离出的细胞，体外培养形成的克隆（CFU-Fs）进行单细胞转录组测序，发现只有一小部分克隆可能来源于真正的骨髓干细胞，表明并非所有通过体外培养形成的克隆都具有多向分化潜能。
第5次单细胞测序：
胎儿骨髓直接分离的原代MSCs和体外培养后的MSCs进行单细胞转录组测序，对原代和体外培养后的MSCs进行了基因表达模式的比较。两种MSCs在基因表达特性上存在显著差异，表明体外培养条件可能对MSCs的特性和功能产生了显著影响。
●●● Highlights ●●●
1.LIFR+PDGFRB+被确定为人胎儿骨髓MSCs早期祖细胞的特异性标记物，这些细胞在体内展示出形成骨组织和重建造血微环境的能力。
2.揭示了人胎儿骨髓中MSCs的多个亚群，展示了MSCs的复杂异质性。
3.比较早期和晚期发育阶段的人胎儿骨髓MSCs，发现它们在转录因子表达和基因调控网络上存在显著差异。
4.体外培养显著改变了MSCs的基因表达模式，提示体外培养条件可能影响MSCs的原始特性和功能。
结果与讨论
1、人胎儿骨髓基质细胞的表达图谱
研究结果：为了探索人类胎儿骨髓基质的细胞多样性，从20周和21周的两个胚胎骨髓细胞进行了单细胞转录组分析，发现大多数20-21周晚期发育阶段的骨髓间充质干细胞是造血细胞。为了捕获相对罕见的骨髓基质细胞，从11-22周9个胚胎骨髓中分选非造血细胞进行了单细胞转录组分析，细胞被注释为七个间充质簇、三个造血簇和一个内皮簇。间充质簇的其中四个表现出成骨细胞（OB）谱系发育轨迹的簇，这些细胞从成骨细胞前体发展到成熟的成骨细胞（OB-P1、OB-P2、OB-P3和OB），一个表达ACAN的软骨细胞谱系簇和一个循环中的间充质细胞簇。还有一个没有明显分化特征的间充质前体细胞簇，命名为间充质前体细胞（MPC）。
2、人胎儿骨髓间充质干细胞的异质性
通过FACS分选表达软骨细胞簇表面标志物的间充质细胞，将分选的单个细胞分别接种到96孔板中，然后将扩增的菌落皮下植入裸鼠背部。扩增的菌落能够有效形成骨组织，说明围产期软骨细胞可以产生新的成骨细胞。
将MPCs进一步分为五个主要亚群，分别是间充质干细胞（MSCs，C01.MSC）、CXCL12+间充质干细胞（CXCL12+MSCs，C02.CXCL12）、软骨细胞前体（C03.Chon-P）以及两个骨形成前体亚群（C04.Ob-P1和C05.Ob-P2）。特别是，C03.Chon-P高度表达了EPYC和HAPLN1，将其注释为软骨前体，C04.Ob-P1显则著表达了关键的成骨细胞特异性基因ASPN和BGLAP。
为了验证MSCs的有效性，选择了MSCs的特异性表面标志物LIFR与PDGFRB的组合，在C01MSC和C02CXCL12中高表达。接下来，通过分选LIFR+PDGFRB+/ CD45- CD31- CD235a-细胞接种到96孔板中，两周后，收获单克隆并移植到裸鼠背部，以验证这两个MSC簇。移植4周后，观察到了大量新的骨小梁。移植8周后，出现了类似于骨髓中的造血现象。
3、早期和晚期发育阶段间MSCs的差异
为了追踪人类胎儿间充质干细胞的起源，对17个6至24周胚胎样本随机挑选细胞使用STRT单细胞RNA测序技术对这些细胞进行了测序，识别出了三个主要群体：内皮细胞、间充质细胞和造血细胞。间充质细胞进一步被分为7个簇。根据差异表达基因（DEGs）将其注释为：间充质前体细胞（C01.Mes）；循环前体细胞(C02.Cyc）；成骨-软骨前体细胞(C03.OCP）；软骨细胞前体细胞(C04.Chon）；晚期成熟软骨细胞(C05，ChonL）；成骨细胞(C06.Ob）；以及肌细胞（C07.Myocyte）。
利用SCENIC工具推断出基因调控网络，并识别了间充质干细胞（MSCs）发育过程中的关键转录因子。在人类早期发育阶段的胎儿骨髓间充质细胞中，发现了PRDM1、HOXD1、HIVEP2、CEBPB、NR1D2、IRX3、KLF9、EGR3等基因可能在C01中发挥重要作用。这些基因的表达水平和调控活性在C01中显著升高。然而，与晚期阶段（11周至22周）的MSCs相比，情况则大不相同。在MSCs中，如LEF1、IRF2、SOX9、TBL1XR1、FOXC1、FOXP1、FOXN3和NR3C1等转录因子高度表达并被激活。
根据BMSCs的发育周数进行了差异表达分析，不同发育周数的BMSCs表现出独特的表达模式，表明BMSCs从第11周到第22周持续发展。接下来，根据基因表达模式将BMSCs的表达基因分为11组。在这些组中，第14组基因的表达水平呈现上升趋势，第1组和第3组基因的表达水平则下降，而第8组基因的表达水平在第16周达到峰值后逐渐下降至第22周。这四组基因参与了不同的生物过程，可能在BMSCs的发展中发挥重要作用。
4、人胎儿骨髓中的细胞-细胞通讯
探讨了MSCs与造血细胞（HC）之间的细胞互动。当MSCs作为配体时，大多数造血细胞，包括嗜碱性粒细胞、髓系细胞、中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞和巨噬细胞，都与MSCs有密切联系。实际上，MSCs在维持造血干细胞（HSC）的关键因素中高度富集，如趋化因子配体12（CXCL12）和干细胞因子（自洽场），并且CXCR4是所有造血细胞类型的受体。相反，当MSCs作为受体时，并非所有造血细胞都与MSCs有密切互动。当MSCs作为配体时，在细胞间的通讯中明显检测到了活性配体-受体对。类似于MSCs，CAR细胞也以相同的方式与造血细胞互动（图4b)。
研究还揭示了每种造血细胞（HC）与间充质干细胞（MSCs）之间的独特相互作用。VCAM1+巨噬细胞也可能调节胎儿MSCs向血管微环境的归巢，而VCAM1+ MSCs和巨噬细胞可能在晚期发育阶段的HSPCs归巢中发挥重要作用。另一方面，CAR细胞分泌ANGPTL2，通过TLR4受体吸引并激活巨噬细胞，产生炎症细胞因子。随后，进一步探讨了间充质干细胞（MSCs）与间充质细胞之间的细胞间相互作用。无论MSCs作为配体还是靶标，它们与其他基质细胞的相互作用都非常强烈。CAR细胞与间充质细胞之间也存在类似的情况。
5、人胎儿骨髓中的CFU-Fs
为了评估间充质细胞的CFU-F活性，从胚胎中分离出的单个间充质细胞接种到96孔板中，培养两周后观察到了26个克隆。随后这些克隆被消化并进行了单细胞RNA测序分析。所有克隆中均高度表达许多先前已知标记间充质干细胞（MSCs）的标志物。
在这些26个克隆中，想知道有多少克隆是从骨髓来源的干细胞衍生出来的，使用单细胞测序分析方法，检查了从分选后的单个TM4SF1+CD44+NT5E+和LIFR+PDGFRB+细胞中提取的单个克隆，这些克隆表现出不同的表达模式。随后利用LIFR+PDGFRB+和TM4SF1+CD44+NT5E+克隆之间的差异表达基因作为各自的特征基因，计算了从整个骨髓来源的单个骨髓来源细胞（BMNCs）中衍生出的26个克隆的特征得分，发现只有少量的集落形成单位（CFUs）被推断来自上述两个干细胞群体。真正的单个干细胞在骨髓中可以形成克隆，但反过来则不成立，因为只有部分集落形成单位（CFU-Fs）在体内移植时是多能的。
6、原代MSC与培养的MSC的比较
先前的研究表明，间充质干细胞（MSCs）在扩增过程中会逐渐丧失增殖能力和分泌特性。因此对新鲜和培养的骨髓单核细胞（BMNCs）进行了比较，以评估可能的变化。主成分分析的第一轴将新鲜和培养的细胞分开，而第二轴则按培养阶段对培养细胞进行了排序，这表明在体外培养过程中基因表达模式发生了显著变化。通过Monocle进行的发展伪时间分析也按照培养阶段对新鲜和培养的细胞进行了分类。将所有这些细胞根据推断的发展伪时间分为28个组，每个组包含50个细胞。接下来，对每个组进行了DEGs分析，发现这些细胞可以分为4个主要簇（C1至C4），每个聚类中的差异表达基因（DEGs）展示了增殖和分化的总体过程。
当细胞在培养基中培养时，LIFR的表达消失，这与长时间培养后NT5E、THY1和ENG显著增加的情况截然不同。
机制总结和临床启示
（一）核心机制
发现LIFR和PDGFRB可以作为人胎儿骨髓MSCs早期祖细胞的特异性标记物，这些细胞在体内能够形成骨组织并重建造血微环境（HME）。 MSCs通过分泌CXCL12和SCF等细胞因子，对造血干细胞的维持和分化起到关键支持作用，阐明了细胞间通讯的具体机制。 揭示体外培养的MSCs与新鲜分离的MSCs在转录组水平上的差异，发现体外培养显著改变了MSCs的基因表达模式，提示了体外培养条件对MSCs特性的影响。
（二）临床启示
文章揭示了体外培养对MSCs特性的影响，为优化MSCs的体外扩增条件提供了重要线索，有助于提高MSCs治疗的效率和安全性。通过理解MSCs的特异性标记物、异质性和发育轨迹等机制，可以更精确地筛选和分离具有治疗潜力的MSCs亚群，从而提高MSCs治疗的效率和安全性。
结语
这篇文章通过单细胞转录组学和功能分析，深入揭示了人胎儿骨髓MSCs的特异性标记物、异质性、发育轨迹、细胞间通讯网络以及体外培养对其特性的影响，为MSCs的基础研究和临床应用提供了重要的科学依据和理论支持。
