英文标题：Single-cell spatial transcriptome reveals cell-type organization in the macaque cortex
中文题目：单细胞空间转录组揭示猕猴皮层中的细胞类型分布
期刊：Cell
影响因子：42.5
发表时间：2023-07-12
DOI：10.1016/j.cell.2023.06.009
灵长类动物的大脑是最为复杂的器官，其中大脑皮质是灵长类脑中最为庞大和发达的一块神经组织，它负责调节多种高级功能，包括感觉、语言和行为等，阐明大脑皮层的细胞组成对于理解脑结构与功能至关重要。本文通过猕猴皮层区域进行snRNA -seq和空间转录组分析，从而研究皮质细胞的多样性和空间组织模式，为理解灵长类大脑的进化、发育、衰老和发病机制提供了细胞和分子基础。
Highlights
1、构建猕猴大脑皮层264 种细胞类型的综合图谱，并描绘它们在整个皮层的空间分布
2、揭示猕猴细胞在大脑皮层层级与区域偏好
3、跨物种（人、鼠）分析揭示了在L4层富集的灵长类特异性细胞类型
研究材料与研究方法
研究材料：食蟹猕猴
研究方法：单细胞转录组测序、空间转录组测序、RNAscope
研究结果
1、单细胞+空间转录组，绘制猕猴大脑皮质层图谱
研究者利用单细胞和空间转录组测序数据，将大脑皮层细胞进行了三级分型。一级分型包括了谷氨酸能神经元、GABAergic神经元和非神经元细胞。二级则是对一级分型中的细胞类型进行了亚群细分，其中谷氨酸能神经元通过其在空间转录组的层分布偏好注释，包括L2、L2/3、L2/3/4、L3/4、 L3/4/5、L4、L4/5、L4/5/6、L5/6 和 L6等；GABAergic神经元亚型根据marker基因注释，包括SST、PV、VIP、CHC、RELN等。非神经元细胞由marker基因注释了星形胶质细胞、少突胶质前体细胞 、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管软脑膜细胞。三级分型则是对二级分型的细胞类型进一步细化，在整个大脑皮质143个区域上共鉴定出264个细胞簇。通过单细胞和空间转录组信息相结合，最终获得了猕猴大脑皮层的细胞类型图谱。
2、猕猴大脑皮层不同细胞类型的空间分布
利用stereo-seq对猕猴大脑皮层进行了空间转录组测序，并使用自主开发的AI自动分割算法进行单细胞识别。随后，研究人员基于弱监督神经网络模型构建了从单细胞到空间细胞类型迁移注释的分类器，将snRNA-seq上鉴定的264类细胞类型注释到空间组单细胞上，为三只猴构建了单细胞解析的细胞类型3D皮质图谱。
通过对Stereo-seq 图谱的分析，研究人员发现可以通过细胞组成区分9个主要的皮质叶。由于相互靠近的细胞往往具有更高形成突触连接的可能，细胞类型在空间上的局部混合很可能表明局部神经环路的差异源于细胞组成。因此，研究人员量化分析了各个皮质层中局部细胞类型组成的“邻域复杂性”，发现细胞类型在不同的皮质层和区域上确实会表现出邻域组成的特异性，如较深皮质层的复杂性高于表层，且皮质区域之间也存在着明显差异。
3、细胞类型组成和分布与皮质层级结构的关联
基于Stereo-seq细胞类型图谱，研究人员通过分析皮质脑区间的细胞密度差异，发现细胞密度和层次水平之间存在显著负相关，即较高级别脑区细胞密度较低。
进一步的分析显著表现出层级依赖性变化的细胞类型，发现其中许多表现出负相关且普遍存在的谷氨酸能神经元会优先定位于早期感觉通路。这些细胞的marker基因与钙离子结合、跨突触信号传导和离子通道活性相关。相反，只有一个GABAergic神经元细胞类型与分层水平均显示为负相关。相反，4个谷氨酸能神经元，5个GABAergic神经元和1种非神经元细胞类型显示出与分层水平呈正相关的分布。这些结果提示了猕猴大脑中细胞组织的一般规律。
4、谷氨酸能神经元的空间组织模式
谷氨酸能神经元是神经元细胞中比例最大的细胞，并在不同区域表现出明显的层偏好，这与之前在小鼠和灵长类动物中的发现一致。基于细胞密度计算，作者发现所有谷氨酸能细胞类型都沿A-P梯度表现出一定程度的优先分布。进一步研究了每种谷氨酸能细胞类型的区域分布，不同谷氨酸能细胞类型高度局限于特定的皮质区域，这些区域特异性谷氨酸能细胞类型也显示了V1、F1和颞极区域的明显邻域组成簇和层特异性。综上所述，谷氨酸能细胞类型在猕猴皮质中的分布具有层和区域特异性。鉴于谷氨酸受体对于驱动皮质电路中的信息处理至关重要，并且在许多脑部疾病中是有效的药物靶点，作者进一步绘制了这些基因的空间分布图，发现许多谷氨酸能受体基因的表达水平与各种皮质区域的层次水平呈正相关。综合表明，谷氨酸能受体基因的协调表达模式可能是不同大脑区域突触功能和可塑性差异的分子基础。
5、GABAergic神经元的空间组织模式
作者接着探索了GABAergic神经元细胞空间定位，发现RELN亚群主要位于L1/2，而LAMP5、VIP和VIP_RELN亚群则主要位于L2/3/4富集。PV和SST亚类分布在L2至L6， CHC亚类在L2和L4富集。所有GABAergic神经元细胞分布在9个皮层叶中，具有不同程度的特异性：视觉皮层中GABAergic神经元的比例较低（V1-V4）；PV亚型在运动皮质（F1-F7）和嗅内区较高；CHC、RELN和VIP亚类在前额叶和扣带皮层突出。在人类皮层中也发现了类似的CHC细胞分布。
作者在猕猴皮层中发现了两组表现出“互补丰度”的SST细胞类型：第一组在额叶前部和扣带回皮层中密度较高，而第二组主要在枕叶和顶叶皮层中分布。第一组在L2和L5层中表现出较高的密度，而第二组仅在L2层中达到峰值。这两个SST细胞组也在基因表达模式和GO条目上有所不同。根据这些SST细胞组的相对密度，所有143个皮层区域可以分为9个皮层叶。
CHC 神经元对锥体神经元的轴突初始段具有支配作用，能够调控神经元冲动的特性。研究人员对这类神经元进行了进一步解析，发现 CHC1、CHC2 亚型在标记基因的表达、空间定位以及邻域组成等方面，与 CHC3 亚型存在精细的差异。综合来看，不同的 CHC 细胞会与不同的谷氨酸能细胞形成不同的局部环路，进而影响神经活动。
由于负责控制输出的 PV 神经元与负责控制输入的 SST 神经元的比例，会造成不同脑区局部环路的差异，研究人员专门检查了 PV 与 SST 的平衡模式。第一主成分分析显示，皮质区域内 PV 和 SST 神经元的组成精细程度，与感觉系统的层级结构水平高度相关，这意味着具有胞体和树突靶向特性的 PV 与 SST 神经元受到严格调控，以支持各类感觉系统的功能。此外，PV/SST 神经元中神经递质和神经调节受体的基因表达，与两个感觉系统的层次水平存在显著相关性，这表明 PV 和 SST 在神经网络处理的多个阶段中，具有响应局部调节的特点。
6、非神经元细胞的空间组织模式
在单细胞数据中确定了6个非神经元细胞类型。这些非神经元细胞类型也显示了跨皮质区域的优先分层定位。例如，EC和VLMC细胞类型主要分布在L1层，OLG细胞在L6层中富集，而ASC分布在整个皮质层中，且几乎所有ASC类型都高表达了谷氨酸转运蛋白和GABA转运蛋白。值得注意的是，研究者还确定了两组ASC，它们分别主要位于L1和L6中。这两组的基因表达模式也有所区别。进一步的分析显示，谷氨酸能受体基因在第二组ASC中表达水平更高。因此，具有不同定位的特定ASC类型可能在猕猴大脑中服务于不同的皮质功能。
在细胞类型的全局解析中，研究人员确定了两组分别定位在 L1和L6皮质层的ASC细胞类型，L6富集的ASC中出现较高水平的谷氨酸能受体基因表达，提示ASC类型对支持皮质功能的潜在贡献。对OLG的分析也获得了类似的发现，两种OLG细胞群分别沿A-P轴的内侧和后部区域集中分布。值得注意的是，研究人员发现了一类在F1脑区存在明显富集的OLG.7 ANLN/MOBP细胞类型。由于周围少突胶质细胞为其周围的神经元提供代谢支持，F1富集的OLG细胞类型可以满足该区域神经元冲动时更高的能量需求。综合表明，猕猴大脑皮质中这些非神经细胞类型具有脑区和皮质层中功能特异的特性。
7、与其他物种相比，灵长类动物细胞类型具有特异性
为了探索灵长类动物皮质中是否会出现新的细胞类型，作者比较了猕猴与人类和小鼠皮层的单细胞数据。跨物种的比较表明，猕猴与人类共享的每个亚类标记基因的数量多于与小鼠共享的标记基因的数量。在人类、猕猴和小鼠的所有8个细胞亚类中，共发现了1630个物种特异性表达基因，但在所有物种的前额叶皮层中，只有201个基因的表达是保守的，这与之前基于单细胞RNA-seq分析的结果一致。尽管这些谷氨酸能细胞亚类在物种之间是一致的，但发现在猕猴和人类的所有三个皮层区域（PFC、M1和V1）中都存在一组L4/5 IT神经元，而在小鼠中则不存在。值得注意的是，发现了六种存在于猕猴和人类PFC、F1和V1区域的谷氨酸能L4细胞类型，而在小鼠中则不存在。空间转录组图谱显示，这些细胞类型优先分布在大多数皮层区域的L4中。进一步使用仅来自内侧和眶额前皮层的细胞进行的跨物种比较分析也揭示了灵长类特异性L4细胞类型的存在，这表明灵长类特异性细胞类型可能与灵长类动物新皮层区域的出现有关。
差异表达分析在6种灵长类动物特异性细胞类型中发现了226个高表达基因。进一步的GO分析显示，这些基因与轴突发生和突触组织有关。其中，FOXP2编码一种参与发育性言语失用症的转录因子。作者进一步量化了猕猴大脑皮层各个区域每一皮质层中FOXP2的表达，发现这个基因在大多数皮层区域的L4中表达水平最高。然而，对于那些没有清晰L4的区域，如额叶皮层和内嗅皮层，FOXP2的表达在L6中最高，这与最近的研究一致。在猕猴和人类的L4中也发现了EPHA3和DCC的类似高表达，RNAscope检测验证了FOXP2和EPHA3在V2的L4中表达水平最高。因此，灵长类皮层的进化扩张伴随着位于L4的灵长类特异性细胞类型的出现，还包括了FOXP2、EPHA3和DCC等基因的区域依赖性层状差异表达模式。
结 语
该研究提供了世界上首个在单细胞分辨率上全面的猕猴大脑皮质组织空间转录组图谱，并为未来大脑组织在进化、发育、衰老和发病机制过程中的分子和细胞研究提供了重要的数据资源库。
