2025-07-15
研究物种：小鼠
发表期刊：Molecular Medicine
发表时间：2024年
影响因子：6
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文章亮点
创新性研究方法：文章采用了一种结合传统中药与现代生物信息学技术的方法，对王氏经验方在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）治疗中的作用机制进行了深入探讨。这种跨学科的研究方式为理解中药复方的作用机理提供了新的视角。
明确靶点与路径：研究表明，王氏经验方能够通过调节Toll样受体4 (TLR4)、核因子κB (NF-κB) 以及环氧化酶2 (COX2) 这条信号传导路径来发挥其抗NAFLD效果。这不仅明确了药物作用的具体分子靶标，也为未来开发更有效的治疗方法指明了方向。
全面的数据支持：研究中使用了大量的实验数据和计算分析结果作为证据支撑，包括但不限于基因表达谱分析、蛋白质互作网络构建等，这些都极大地增强了结论的可靠性和科学性。
潜在临床应用价值：通过对王氏经验方抗NAFLD机制的解析，该研究为寻找新的治疗策略提供了理论依据，并可能促进相关药物的研发进程，具有重要的临床转化意义。
强调个性化医疗的重要性：虽然主要讨论的是特定配方的作用机制，但文中也提到了不同个体间可能存在差异，暗示了未来在NAFLD治疗上实施更加个性化的医疗方案的可能性。
总之，这篇论文通过综合运用多种先进技术手段，揭示了一个传统中药方剂对抗NAFLD的新颖机制，对于推动中医药现代化及提高NAFLD患者的生活质量具有重要意义。
研究背景
众所周知，自从进入21世纪以来，随着人们饮食结构和生活习惯的改变，由营养过剩和代谢紊乱所引起的非酒精性脂肪肝（NAFLD）已然成为全球最为常见的慢性肝病之一。据统计，在中国，高达29.81%的成年人患有NAFLD。根据估算，中国2030年NAFLD患者的数量可能高达3.15亿。而重度NAFLD或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）可能进一步进展为肝衰竭、肝硬化甚至肝癌，对人们的生命健康造成极大威胁。更为迫切的是，目前还没有药物能够有效和完全地治疗NAFLD。
中医药是中华传统文化的瑰宝，而中医经验方则凝聚了名老中医多年临床实践的经验与智慧。本研究正是挑选了Wang Kun-Gen教授在中医治疗NAFLD时所使用的经验方（WSF）作为研究对象，结合一系列实验方法和生信分析对其进行研究的。
研究思路
研究方法
质谱药物成分分析，网络药理学，分子实验
研究结果
1.WSF可减轻小鼠NAFLD
研究者使用了高糖、高脂饮食方案构建了ICR小鼠NAFLD模型，并设置了对照组和多烯磷脂酰胆碱（PPC）阳性对照组。研究结果显示，相较于NAFLD模型组小鼠，给予WSF或PPC给药均能显著降低小鼠体质量、附睾脂肪指数及其质量，且肝脏指数及其质量也呈下降的趋势。通过基于H&E和ORO染色的组织病理学检查，研究者发现PPC和WSF给药均能显著缓解由高糖、高脂饮食所造成的肝损伤和脂滴累积。同时，血清AST和ALT水平也显著下降，这些指标常作为衡量肝损伤的血清生化指标。研究者进一步关注了WSF对于糖脂代谢的影响。通过检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU等指标，明确了WSF可显著改善NAFLD小鼠的糖脂代谢，达到了与PPC相似甚至更强的疗效。上述研究结果显示WSF可显著缓解小鼠NAFLD，有进一步研究其分子机制的价值。
图1：WSF对NAFLD小鼠体质量和内脏脂肪积累的影响
图2：WSF对NAFLD小鼠肝脏功能及其病理学特性的影响
2.基于高效液相色谱-质谱联用分析WSF的化学成分组成
从事药理学及相关研究方向的研究者应该清楚，如果某种单体药物表型非常明确，下一步可基于单体结构开展分析。然而，以中医经验方等为代表的中医复方由于药味组成复杂、化学成分繁多，对于其分子机制的研究具有较大的不确定性，且可重复性往往较差。因此，对复方的化学成分检测是必不可少的，只有明确了复方主要成分的组成，研究成果才有说服力。高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）是一种将高效液相色谱（HPLC）与质谱（MS）结合的分析技术。这种技术结合了色谱和质谱二者的优点，可连续完成样本的分离和定性/定量分析，我们可以将HPLC看作MS的进样装置，也可以将MS看作HPLC的分析装置，二者取长补短，相得益彰。该研究所使用的HPLC-Q-TOF/MS更适用于定性而非定量分析。分别在正、负离子模式下获取WSF的总离子流图，经过与化学结构数据库比对和文献分析，共识别到39种潜在的生物活性成分，糖苷类、生物碱类、苯丙素类、酚酸类化合物等。研究者希望基于这些化合物的结构，通过网络药理学的方法预测其分子机制。
图3：HPLC-MS正、负离子模式下的WSF化学成分分析总离子流图
3.网络药理学和分子对接探索WSF抗NAFLD的分子机制
除了HPLC-MS所筛选到的39种成分以外，研究者还从文献和数据库中搜集了一些WSF各药味所包含的化合物作为补充。将总计72种化合物导入Swiss Target Prediction平台进行靶点预测。该平台所采用的算法可结合小分子与蛋白质的结构，计算那些可能的结合模式，并给予一项评分来评估对应小分子-蛋白质产生互作的可靠性。
经预测和筛选，共获取878个靶蛋白，将这些靶蛋白与来源于OMIM、GeneCards、DisGENET数据库中的NAFLD相关靶点取交集，共得到254个交集靶点，即WSF有可能作用于这些靶点发挥抗NAFLD作用。
进一步使用Cytoscape软件构建WSF成分-交集靶点互作网络，并通过软件内置的Network Analyzer分析网络的拓扑学属性，挑选那些Degree值更高的靶点；同时利用STRING数据库生成交集靶点的蛋白互作网络，使用CentiScape 2.2 插件进行拓扑学分析、Cytoscape软件进行可视化，综合考虑多个拓扑学参数，如Degree值、Betweenness centrality值、Closeness centrality值等，筛选关键靶点，所筛靶点包括TNF、IL6、AKT1、IL1B、PPARG等。
图4：通过网络药理学探索WSF抗NAFLD的潜在分子机制
进一步利用DAVID数据库进行KEGG和GO生物富集分析，将所预测得到的靶蛋白进行富集，发现WSF的抗NAFLD作用很有可能与NF-κB信号通路、TLR信号通路相关。为了增加网络药理学预测结果的可靠性，研究者对TLR4、NF-κB、COX-2等重点关注的靶蛋白与WSF中主要的生物活性成分进行了分子对接分析，计算其结合能，发现大多数蛋白受体及其配体之间的结合能均低于-5 kcal/mol。以JGL8组分与COX-2蛋白的分子对接结果为例，JGL8可结合到软件所计算到的COX-2蛋白活性口袋，与其ASN-39、CYS-47、SER-49等8个氨基酸残基形成氢键，稳定结合。这些结果说明配受体之间具有良好的亲和力，即网络药理学预测结果较为可靠。
图5：通过分子对接初步验证网络药理学所预测的靶蛋白与小分子单体之间的结合能力
4.利用免疫组织化学、Elisa和Western Blot进行分子机制验证
在基于免疫组织化学的验证实验中，研究者分析了肝组织TLR4、NF-κB、COX-2和IL-6的蛋白水平，发现这些蛋白在小鼠NAFLD造模后显著升高，而WSF给药后显著降低；在Elisa实验中，发现WSF给药能显著降低NAFLD小鼠肝脏IL-1β和TNF-α的水平；在Western Blot实验中，发现WSF给药可显著降低小鼠肝脏TLR、NF-κB和COX-2的蛋白表达水平。这些结果验证了上述分子机制预测的靶点，说明WSF很有可能通过靶向TLR4/NF-κB/COX2途径，影响IL-1β、IL-6产生，最终缓解NAFLD。
图6：Western Blot检测WSF给药后部分靶蛋白的变化水平
图7：免疫组织化学和Elisa检测WSF给药后部分靶蛋白的变化水平
结论
该研究选取了WSF作为研究对象，利用NAFLD小鼠模型阐明其药理活性。而后通过HPLC-MS分析WSF的化学成分组成，并基于这些化学成分通过网络药理学和分子对接探索WSF抗NAFLD潜在的分子机制，最后通过免疫组织化学、Elisa和Western Blot对一些关键的靶蛋白进行验证。该研究为中医经验方开展研究和中医药现代化提供了参考，值得学习。而该研究的不足则在于对分子机制的验证较为局限，期待该研究团队的后续成果。
