2025-08-24
在空间转录组技术中，样本处理的每一个细节都直接影响实验结果的可靠性。从组织采集到测序前的质控，任何环节的疏漏都可能导致数据偏差甚至实验失败。本文将围绕样本处理全流程、质控标准、避坑指南等展开，为您呈现空间转录组样本处理的标准。
一、空间转录组测序样本准备与处理
1、空间转录组实验设计与样本重复数
（1）空间转录组实验设计和样本选择
①肿瘤疾病方向：
肿瘤vs正常（癌旁）、肿瘤不同进展时期、肿瘤不同区域、泛癌的组织样本，揭示肿瘤发生发展过程中，样本的空间异质性；
同治疗方法和不同预后程度设置组别取样，比较不同治疗方法（如手术、放疗、化疗）对肿瘤微环境的影响，探讨治疗效果的分子机制，及分析不同预后程度 （如生存期长短） 的肿瘤患者的空间转录组特征，寻找潜在的预后标志物。
②神经发育方向：
胚胎、脑、肠、肺等按照发育时期取样，发育时期推荐至少3个取样点，若通过其他研究已聚焦某个关键发育时期，可选取特定发育阶段的组织样本，揭示其背后的空间分子机制。
（2）空间转录组样本重复设置建议
①区分生物重复与技术重复：
生物重复：指不同来源的独立个体（例如，不同的小鼠、不同的病人样本、来自同一个体的不同器官/组织块）。空间转录组实验的核心是必须有足够的生物重复。
技术重复： 指同一份生物样本在实验流程（如切片、文库构建、测序）中的重复处理。例如，对同一组织块的相邻切片分别进行空间转录组检测。
②设置生物重复数量的建议：
每组至少3个，强烈推荐4-6个或更多独立的生物重复，是获得可靠、可重复且有统计学意义结论的基础。
2、空间转录组样本处理全流程
（1）样本准备
①OCT包埋
新鲜组织样本，建议在30min内包埋，取下后迅速用预冷的PBS溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。此步骤一定要吸干水分，如有液体残留，OCT包埋后，组织表面形成冰晶，影响切片效果，整个样本处理过程需要保持低温环境。
注：包埋好后最好立即送样切片，暂时储存可在-80℃存储3个月内，可以干冰过夜运输寄送即可；
②石蜡包埋
尽可能取活性较好的组织样本并随即投入固定液。材料应该小而薄，一般厚度大于3mm，大小不超过6.5×6.5mm2；
注：蜡块存放于室温或 4~8℃，石蜡包埋样本需要冷冻冰袋送样（2-3个即可），无需干冰，顺丰寄送；蜡块制作流程，要求脱水充分、浸蜡充分，切片可连续切片成片、无裂痕和空腔（组织本身自带除外），样本切片过程中不会与外部包埋的蜡分离。
（2）选片
无论是新鲜冷冻组织样本还是FFPE样本，都需要通过普通HE染色，选择组织形态的完整性较好的切片进行后续实验。
（图片来自10x）
（3）正式实验
①组织透化
10×Visium组织预透化（Tissue Optimization，也叫组织优化）：连续切片子，在预透化玻片上进行组织预透化实验，其目的是摸索最佳的mRNA释放时间（透化时间），以便达到最好的实验效果。具体过程如下：
选择目标区域附近的组织切片，在普通玻片上进行固定和染色；采用不同的时间梯度，进行透化处理，6个透化梯度时间样本（官方推荐3/6/12/18/24/30 min），1个阴性对照，1个阳性对照；用带有荧光的核苷酸进行反转录合成cDNA。酶处理移除样本组织，然后对带有荧光标记的cDNA进行成像；对比H&E和荧光成像，选择荧光信号较强、mRNA弥散较小、内部组织结构清晰的时间点，作为正式实验透化时间点。
华大Stereo-seq预透化：
对新鲜或冷冻组织进行 OCT 包埋，连续切取厚度为 10μm 的切片。建议制备至少 4张用于透化测试的切片，并额外保留2张用于H&E染色及质检。具体实验过程根据华大 STOmics Stereo-seq 透化试剂套装进行预透化实验，最终选择在组织移除干净且保持相同成像条件（包括亮度和曝光等条件）的情况下，以组织形态完整、荧光值较强且无弥散为最佳透化时间的判断标准。
②cDNA文库构建
使用组织表达芯片进行空间转录组文库制备。按照最佳组织透化时间进行组织透化，释放组织mRNA与芯片上的捕获序列结合，逆转录合成cDNA片段并标记空间位置，PCR扩增合成cDNA二链。通过碱性环境使cDNA变性将cDNA二链释放到液体游离环境，以cDNA二链为模板进一步扩增合成大量cDNA。将cDNA酶切打断成200-300bp的片段，加上P5接头、i5样本索引、read 2、i7样本索引和P7接头构建标准测序文库。
（4）上机测序
使用Illumina 或华大T7测序平台进行上机测序。
（5）数据分析
利用10×Space ranger 数据或Stereo-seq Analysis Workflow软件对测序获得的原始数据进行初步分析，组织染色照片和芯片序列号一同输入软件进行数据质控和序列比对，从而获取高质量的测序数据、Spot/Bin在组织中的空间分布位置以及基因在各个Spot/Bin 的表达量情况。随后利用这些数据开展分群、亚群特征基因分析、Spot/Bin 注释、空间拟时分析、空间通讯分析等深入研究。
二、空间转录组测序样本质检
空间转录组测序样本质检中，RNA 完整性是核心指标，直接影响基因表达数据的可靠性及检测基因的完整性。其评估常通过 RNA 完整性数值（RIN）衡量，数值越高，代表与空间转录组探针结合的几率就越高。其次新鲜冷冻OCT包埋（FF）（RIN≥7） vs石蜡包埋 FFPE（DV200≥30%）组织的质控阈值不同。
1、新鲜冷冻OCT包埋组织
新鲜冷冻组织的 RNA 质量主要以 RIN 值衡量，该值通过 Agilent 2100 生物分析仪基于电泳图对真核总 RNA 质量分类，范围 1-10，1 代表降解严重、10 代表完整性高。
注：通常切取 10 片组织切片进行 RNA 抽提和质检，建议使用 RIN 值＞7 的样本开展空间实验。
（不同样本的rin值检测图片，来自安捷伦官方）
2、FFPE组织样本
石蜡包埋（FFPE）组织是生物学尤其是医学领域常见的组织保存形式，但该方式会导致DNA/RNA 降解，mRNA的polyA尾断裂，故采用DV200 进行检测，DV200指超过 200 个核苷酸RNA片段百分比，其值越高，RNA完整度及与空间探针的结合概率越高。
一般切取5-10片FFPE组织切片进行RNA抽提并进行DV200检测，建议使用DV200≥30%的FFPE样本进行Visium实验。
三、避坑指南
空间转录组各种不好处理的样品组织如骨组织（硬骨、软骨）、脂肪、血管、肌肉、皮肤专用处理方案。
1、骨组织
硬骨组织坚硬、需脱钙、透化难。软骨组织高基质密度阻碍透化/RNA释放，因此硬骨和软骨务必进行温和脱钙（推荐EDTA，避免强酸），严格监控时间防止过脱钙。显著延长透化时间或使用增强型透化试剂，确保RNA有效释放。处理全程保持低温，保护RNA。
2、脂肪组织
脂肪组织结构特殊，含有较多的油脂成分，无论是冰冻切片还是石蜡包埋切片都较其他组织困难。小鼠/人优先FFPE或FF，其他选 FF；FFPE制备需用固定液，纱布盖防漂浮，严控无水乙醇、二甲苯脱水时间；对于FF样本，相比于其他组织，脂肪组织通常需要更厚的切片，推荐10-20μm。
3、血管组织
血管组织由内皮细胞、平滑肌、结缔组织及弹性纤维构成，管壁分层明显（内膜、中膜、外膜），质地较脆且易收缩，血管腔易塌陷，无论是冰冻切片还是石蜡包埋切片都较其他组织困难。小鼠 / 人血管组织优先 FFPE ，因为其采用的OCT包埋剂灌注难度较大。血管 FFPE 样本因管壁含较多弹性纤维，易出现切片碎裂，建议采用防脱载玻片，因血管组织切片在水浴中易发生腔室变形，故可降低展片温度并缩短展片时间。
4、肌肉组织
肌肉组织由肌纤维与结缔组织构成，肌纤维排列有序且韧性较强，肌纤维与结缔组织结合紧密程度不一，切片时易出现肌纤维断裂、切片褶皱、层次分离等问题。小鼠/人肌肉组织优先采用FF或FFPE组织形式，优先选择FF，OCT作为冷冻包埋剂，能在低温下快速固定肌纤维排列，减少冰晶对肌纤维的损伤，且无需高温处理，可最大程度保留 RNA 的分子活性，更适配空间转录组对基因表达原位信息的精准捕捉。
5、皮肤组织
皮肤由表皮和真皮构成，与皮下组织相连，由于皮肤层次丰富，结构复杂，质地坚韧，各层细胞间的致密度不同，在切片中常出现皱网状层松散、浅层出现碎裂等。建议人和小鼠物种采用FFPE组织形式。取材时切下皮肤愈早固定愈好，防止时间过长引起组织收缩变形或发生自溶。包埋组织包埋时表皮朝上，皮下组织朝下，切片时依次从皮下组织、真皮层、表皮层，最后切角质层。皮肤FFPE样本高脂质含量，粘性较低导致脱片，建议采用防脱载玻片，因皮肤组织切片在水浴中能迅速膨胀，故可降低展片温度。
四、总 结
空间转录组实验成败，样本处理是核心。从科学设计（合理选样、充足生物重复）、全流程规范操作（包埋、透化等），到严格质控（FF的RIN≥7、FFPE的 DV200≥30%），再到特殊组织专属方案，每步精细把控，方能保障数据可靠，助力科研工作者更精准地解码生命的空间奥秘。
