2017-02-23
以PacBio公司的SMRT单分子实时测序技术（Single molecule real-time sequencing）为代表的三代测序技术，通过其独有的环形一致性测序模式（Circular-consensus sequence，CCS），极大提高单碱基测序的准确率，远超Illumina等二代测序技术。与传统转录组测序项目相比，利用PacBio平台的全长转录组测序技术可以直接获得mRNA的全长，保证了mRNA序列的精确性。近期我们将陆续推出全长转录组测序技术相关文章，供讨论和交流。本期将为大家介绍全长转录组测序的技术原理和实验流程。
技术原理
PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。芯片上有很多零模波导孔（ZMW，zero-mode waveguides），每个孔底部均固定着DNA聚合酶。在文库构建时将双链模板DNA两端加上Adapter，形成一个环状单链DNA，每个环化后的DNA会落在一个零模波导孔中，与底部的DNA聚合酶结合。用4种颜色的荧光标记4 种碱基（即是dNTP）。在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。而由于模板DNA是环状，DNA聚合酶会一直围绕模板DNA一圈一圈合成配对的DNA链。
实验流程
将提取的总RNA进行反转录，合成cDNA并加接头序列；根据片段大小将cDNA进行分割；将cDNA进行环化处理，并上机测序。详细流程请见下图：
下一期，我们将针对全长转录组测序的分析流程进行阐述，敬请期待。
