在阅读文献的时候，经常可以看到下方样式的图。此类图通过整合KEGG通路和通路里相关基因/蛋白/代谢物的表达情况，从而直观的表明实验机制，是讲好一个“故事”的重要手段。
示例图1（10.1016/j.envpol.2023.121340）
示例图2（10.1016/j.scitotenv.2023.161751）
示例图3（10.1016/j.scitotenv.2021.151075）
我们以第一个示例图为例子，结合文章，可以发现这个是谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）的通路。在KEGG网站（https://www.kegg.jp/pathway/map00480）上可以看到这整个通路看起来是很复杂的，但是作者基于自己研究目的和分析结果，对这个通路进行简化（下方第2个图里标颜色的）。
在确定好通路的主干后，我们再来确认通路的组成情况。在KEGG通路图上（具体通路图解释可以参考下方图片，或KEGG数据库官网的help链接https://www.kegg.jp/kegg/document/help_pathway.html），圆圈代表代谢物，长方形代表酶（蛋白/基因），代谢物通常会写上名字，而酶写成EC编号。
了解通路图后，我们需要去找到方框里酶对应的基因都是哪些。
第一种
PARRT-01
我们直接在KEGG官网通路图里将鼠标放到方框上，可以看到对应的大K编号（①），然后再到我们表达量表（或者是差异表）里的KEGG注释列，检索对应的K号（②），就可以筛选出对应的所有基因（差异基因）。
第二种
PARRT-01
直接到我们富集分析结果的KEGG通路图里，将鼠标放到有着色的方框上，左上角能显示这个框对应的差异基因有哪些。
好了，现在需要的信息都获取到了，我们就可以开始画图了。可以使用一些矢量图绘制软件比如AI、PS，此外还有更简单的方法，就是用PPT去绘制。
步骤1
PARRT-01
我们用PPT的图形、箭头、文字工具，先绘制出基础框架；
步骤2
PARRT-01
基于找出来的基因表达量去绘制热图并整合到框架内；
A、首先我们从表达量和差异表出找出了通路图各个部分差异基因的FPKM表达量；
B.1.1、然后可以用我们热图小工具（https://www.genescloud.cn/chart/InteHeatMap）去绘制热图，上传找出基因的表达量表（样品或者是组内取均值）和分组文件分析，图表调整里配色可以选经典的红白蓝配色、选择不聚类，我们就得这些基因的热图；
B.1.2、参考示例，按照不同处理，分别创建2个矩形，线条可以填充为灰色（白色或其它颜色，也可以取消），矩形内部颜色可以吸取热图对应方框里的颜色，并用文字工具添加基因名称；
B.1.3、热图方框绘制完成后，可以添加热图图例。插入矩形框，线条选无，颜色选3色渐变（可以到热图的图表设置里点开颜色的＋号，查看具体的配色；红白蓝3色渐变），再添加对应的数值文字；
B.1.4、绘制完成后，可以输出为PDF/图片。
B.2.1、有时候基因太多、样品太多，我们就可以直接基于excel去处理热图部分。首先在绘制热图的时候我们一般都需要对FPKM表达量进行标准化处理，通常来说是做z-score log2（FPKM+1）处理。在excel里，我们可以先用=LOG(B2+1,2)去做对数变换（因为FPKM有0值，所以会加上1，也可以加0.01、0.001；如果需要按组绘制的话，需要先算组内均值，再对数处理），再用=(B2-AVERAGE($B2:$J2))/STDEV.S($B2:$J2)去做z-score标准化；
备注：B2为需要计算的单元格，B2:J2为需要计算的单元格所在的整行数据，$为锁定单元格；AVERAGE为计算均值，STDEV.S为计算标准差；
B.2.2、通过excel的条件格式→色阶→其它规则→三色刻度→可以设置为红白蓝3色渐变（中间值为0，最大最小值可以基于数据填写或取整），对得到的z-score log2（FPKM+1）矩阵进行标注颜色；
B.2.3、然后我们可以选中数值单元格，设置单元格格式→自定义→输入“;;;”→确认，从而达到隐藏单元格数字的目的；调整单元格的宽度，得到需要的比例；
B.2.4、再将需要的基因颜色框选中，复制粘贴到PPT里，再写上基因名称，图例条，即可保存。
步骤3
PARRT-01
这样我们的通路+热图就完成了。通过改变选择的通路和热图的数据，可以绘制多种样式的图。例如：通路上的代谢物，也可以在KEGG文字上找到对应的结构式；热图数据可以是样品表达量标准化、组内取均值标准化、比较组log2fc值、比较组差异情况等。
完美！大家也来试一试吧！
