2025-11-04
Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study
发表期刊：Cardiovasc Diabetol
影响因子：10.6
发表时间：2024
队列1：38 名患者血浆（T2DM 与 CAD 组，n = 12;T2DM 组，n = 12;CAD 组，n = 8;对照组，n = 6
队列2：94 名（T2DM 与 CAD 组，n = 30;T2DM 组，n = 30;CAD 组，n = 16;对照组，n = 18）
样本类型：血浆
组学技术：miRNA测序
研究背景
2型糖尿病（ T2DM）是一种以胰岛素抵抗和高血糖为特征的慢性代谢性疾病，在加速内皮损伤和心血管并发症的发生中起着至关重要的作用，使糖尿病患者患冠状动脉疾病（CAD）的可能性是非糖尿病患者的2-4倍。
目前，有创冠状动脉造影仍然是诊断CAD的金标准，由于其侵入性和电离辐射、造影剂的潜在副作用，该技术的常规使用受到限制，因此，非常有必要寻找替代的非侵入性工具，这些工具可以提供附加预测信息，以改善 T2DM 患者 CAD 的风险分层，从而避免不必要的侵入性检查并积极预防糖尿病动脉粥样硬化的发展。
技术路线
图1 技术路线
步骤1：收集了来自患有和不患有 CAD 的 T2DM 患者、CAD 患者和健康对照的 38 份血浆样本，用于miRNA 表达谱分析。
步骤2：为研究差异表达miRNA靶基因的调控作用，利用多种生物信息学工具进行功能注释和通路富集分析。然后，利用Cytoscape软件中的STRING数据库建立蛋白质-蛋白质相互作用网络，然后进行聚类分析和枢纽基因鉴定。
步骤3：在 94 名参与者的较大复制队列中进行逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）以验证微阵列数据。
步骤4：采用受试者工作特征分析评价miRNAs的诊断价值。采用多因素logistic回归分析建立基于miRNA的诊断模型。
结 果
1.研究组和对照组的基线特征
与非 T2DM 个体相比，T2DM 患者的 HbA1c 水平和空腹血糖浓度显着更高。研究组在一系列临床和生化参数（SBP、DPB、TC、TG、LDL-C、hs-CRP、血小板、纤维蛋白原、尿酸和肾功能）方面均无差异，表明排除了与血管并发症相关的混杂因素。在研究的发现和验证阶段，T2DM-CAD 患者（100%）和 CAD 患者（100%）的高血压发生率高于 T2DM 患者（91.67% vs. 96.67%）。在所使用的降压治疗方案方面没有观察到显着的组间差异。
2.差异表达 miRNA 的筛选
得到了 18 个 DE-miRNA ，其中 3 个在 T2DM-CAD 组和 T2DM 组之间上调，15 个下调。在T2DM-CAD患者和对照组之间总共发现了35个DE-miRNA。此外，在 T2DM 个体和健康对照之间鉴定出 5 个 DE-miRNA，而在 T2DM-CAD 组和 CAD 组之间检测到 4 个 DE-miRNA。最后，这些DE-miRNA组的比较允许提取12个仅适用于患有CAD的T2DM患者的DE-miRNA。
表1 发现队列中T2DM-CAD组和T2DM组之间miRNA显著失调
3.功能注释和通路富集分析
由于特定的miRNA可能作用于多个靶标，因此DIANA-miRPath v3.0工具用于识别T2DM-CAD和T2DM患者之间12个DE-miRNA中每个DE-miRNA的基因靶标对应的前10个最重要的KEGG通路和GO注释。随后，使用 Cytoscape v3.10.0 软件可视化所选上调和下调 miRNA 之间可能的关系。相互作用网络在功能上将 11 个 miRNA 连接在一起，只留下一个下调的 has-miR-4706 没有功能连接。
图2 T2DM-CAD 中 DE-miRNA 的功能网络及其前 10 条途径和生物学特征
使用 miRNet 2.0 工具分别对上调和下调 miRNA 集进行功能富集分析。上调 miRNA 的基因靶点在癌症相关通路、信号转导、代谢、钙离子和蛋白质结合、细胞-细胞通讯、细胞黏附以及细胞连接组织等方面相关术语中显著过量表达。在下调 miRNA 这一组中，最突出的通路是神经营养因子信号通路以及 Wnt 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的信号通路。此外，它们还被发现调节与转录和翻译、内分泌系统、细胞群落以及锌离子结合相关的进程（图 3B）。
图3 T2DM-CAD和T2DM之间DE-miRNA靶向基因的功能富集分析
4.蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
分别针对上调和下调的 miRNA 构建了 12 个差异表达 miRNA 的验证靶基因的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络。接下来，使用 MCODE 算法对所有节点和边进行了聚类分析，得到了6 个最高排名的簇。簇 I 与 RNA 代谢相关，而簇 V、IX 和 XI 被发现与转录和翻译过程中的多个步骤有功能联系。簇 II 和 VII 主要涉及细胞周期。
图4 T2DM-CAD中DE-miRNA靶基因的PPI相互作用网络
5.关键基因鉴定
对于上调的miRNA，前10个枢纽基因是磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、蛋白激酶C α（PRKCA）、丙酮酸激酶M1/2（PKM）等。对于下调的 DE-miRNA，肌动蛋白 β （ACTB）、MYC 原癌基因（MYC）、Ras 同源物家族成员 A （RHOA）等被发现为前10个枢纽基因。在上调和下调miRNA的枢纽基因网络中，PTEN和ACTB被指定为关键枢纽基因，节点度分别为72和119。通过DE-miRNA-hub基因网络构建，发现大多数hub基因可能被上调的has-miR-4505和has-miR-4743-5p以及下调的has-miR-3613-3p和has-miR-4668-5p调节。
图5 DE-miRNA靶基因PPI网络中排名前10的枢纽基因
6.通过 RT-qPCR 验证差异表达的 miRNA
在所有样品中不断检测到has-miR-4505、has-miR-4743-5p和has-miR-4750-3p，但has-miR-3613-3p和has-miR-4668-5p只能通过RT-qPCR检测到非常低的水平，因此无法进行有效定量。因此，这两种miRNA被排除在后续分析之外。
与研究的发现阶段类似，发现has-miR-4505和has-miR-4743-5p显著上调，而has-miR-4750-3p在T2DM-CAD组中与T2DM组相比下调，T2DM-CAD组与对照组相比均下调。与 T2DM 个体相比，has-miR-4505 中检测到 miRNA 表达增加最多，变化了 6.64 倍，has-miR-4750-3p 的表达水平降低了 3.50 倍。
图6 比较验证队列中 T2DM-CAD、T2DM、CAD 和对照组的 miRNA 表达
7.测试的miRNA在T2DM-CAD中的诊断价值评价
进行ROC曲线分析，评价3种已鉴定的miRNA作为T2DM中CAD候选生物标志物的诊断价值。所有三种miRNA，has-miR-4505、has-miR-4743-5p和has-miR-4750-3p，均显示AUC分别达到0.876、0.860和0.833，表明它们在区分T2DM-CAD和T2DM患者方面具有良好的诊断潜力。
图7 验证集中选定 miRNA 的 ROC 曲线分析
8.鉴定用于 T2DM CD 检测的最佳 miRNA 组合
为了研究分类能力最强的miRNA组合对T2DM-CAD和T2DM受试者的区分，建立了logistic回归模型。根据研究验证阶段获得的miRNA表达水平结果，推导出了4个模型：模型1以has-miR-4505和has-miR-4743-5p的表达为自变量，模型2包括has-miR-4505和has-miR-4750-3p，模型3基于has-miR-4743-5p和has-miR-4750-3p的表达，而模型4则包括所有三个变量。数据表明，由has-miR-4505、has-miR-4743-5p和has-miR-4750-3p组成的3-miRNA组合在检测T2DM中CAD的最佳分类准确度。
图8验证队列中基于miRNA的诊断分类模型的ROC曲线
文章总结
本研究使用微阵列技术揭示了患有共病 CAD 的 T2DM 患者血浆 miRNA 的独特特征。综合生物信息学分析表明，DE-miRNA靶基因主要富集在细胞过程调控、基因表达、脂肪酸代谢、氧化应激反应、神经营养因子信号通路和白细胞跨内皮迁移相关的通路中，已知参与糖尿病动脉粥样硬化的发生。我们独立证实，与T2DM受试者相比，has-miR-4505和has-miR-4743-5p在T2DM-CAD患者中显著过表达，而has-miR-4750-3p在T2DM-CAD患者中下调，可能作为糖尿病加速CAD的新型非侵入性分子标志物。我们创新性地开发了一种基于has-miR-4505、has-miR-4743-5p、has-miR-4750-3p联合表达的三miRNA模型，可以有效检测白种人群T2DM中的CAD。
