2017-12-14
微卫星DNA（Microstatellite），又称简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR），指基因组中由1-6个核苷酸组成的串联重复序列，广泛分布在各种真核生物基因组中。微卫星DNA的两端一般是比较保守的单拷贝序列，据此可设计特异引物进行PCR扩增。根据串联重复数不同，可以揭示微卫星DNA长度的多态性，而具有长度多态性的片段可用作分子标记。微卫星标记因具有多态性丰富、分布广泛、遗传共显性等优点广泛应用于遗传图谱构建、分子标记辅助育种、种质资源鉴定、遗传多样性研究等领域。
微卫星标记开发的方法有很多，主要可分为以下三类：（1）利用数据库/相关文献进行搜索和查找；（2）近缘物种间引物交叉扩增；（3）从gDNA、cDNA、EST中筛选微卫星位点。随着高通量测序技术的不断发展，其在微卫星领域中的应用也越来越广泛。通过高通量测序进行的微卫星标记开发方法主要有：（1）基因组测序（genomic SSR）；（2）转录组测序（EST-SSR）；（3）SSR文库富集测序。本文列举了几种常用的基于高通量测序的微卫星DNA开发方法及相应的文章解析，下面就让小编带领大家共同一探究竟吧！
1. 基于富集文库测序的微卫星DNA开发方法
文章题目：High-throughput microsatellite isolation through 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing of enriched DNA libraries
发表期刊：Mol Ecol Resour 2011.02 IF: 7.332
研究背景：
无参物种由于没有可用的基因组信息以及重复序列从头组装困难等问题的困扰，使得其微卫星标记的开发和利用存在一定的限制。目前，微卫星标记的开发多采用鸟枪法测序技术进行。然而，由于随机测序的SSR分离效率较低，数据浪费问题比较严重。故该研究报道了一种将SSR文库富集技术与焦磷酸测序有效结合的微卫星DNA分离方法。
研究方法：
基因组DNA超声或酶切打断后，利用8种生物素标记的探针杂交捕获SSR序列，将文库富集后进行测序，测序平台为454 GS-FLX。该方法首先在模式生物意大利蜜蜂中进行流程优化，然后在其它13个物种（含动植物和真菌）中验证和评估有效性。
研究结果：
在所试验物种中共获得11497-34483条序列，微卫星位点数量从199至5791不等。研究结果表明，富集文库测序能够有效提高微卫星分离效率，与不富集相比效率提高约300%。同时减少不需要的motif类型及比例（如AT motif由于难扩增很少用于基因分型）。因此，该方法能够成功应用于许多非模式物种的微卫星标记开发，且和传统方法相比，能够有效节约成本。
2. 简化基因组测序开发新的亚麻SSR分子标记
文章题目：Development of Novel SSR Markers for Flax (Linum usitatissimum L.) Using Reduced-Representation Genome Sequencing
发表期刊：Fronts Plant Sci 2017.01 IF: 4.298
研究背景：
亚麻是一种重要的纤维和油料作物，开发亚麻的分子标记对于提高亚麻产量和改善亚麻质量具有重要意义。目前，RAPD、AFLP和ISSR等方法已被用于亚麻分子标记的开发，但这些方法既耗时耗力，又不能获得较好的重复性。
研究方法：
采用简化基因组进行测序，测序数据量为2G，测序平台为Illumina HiSeq 2000 （2*100bp），利用SOAPdenovo组装后mapping到亚麻参考基因组。利用MISA软件对二至六碱基核苷酸重复的SSR进行搜索；利用Primer Premier软件进行引物设计。
研究结果：
在亚麻基因组中共鉴定到1720个SSR位点，其中有1574个SSRs是新发现的。SSRs motif类型主要以三碱基重复（56.1%）和二碱基重复（35.23%）为主（表1）。
表1 不同类型SSR motif的频率
采用62对引物对中国东北部的48种亚麻进行多态性鉴定，发现他们主要分为纤维用亚麻和油用亚麻两类（图1）。值得注意的是，在纤维用亚麻中，栽培种“NEW1”和“Venus”的遗传背景显著不同。类似地，“A0529”的遗传背景也不同于其他油用亚麻。因此，这三个亚麻栽培种对亚麻育种来说具有重要意义。
图1 基于SSR分子标记的亚麻遗传多样性分析
3. 毛花猕猴桃的转录组微卫星标记开发和应用
文章题目：Development and Application of Transcriptome-Derived Microsatellites in Actinidia eriantha (Actinidiaceae)
发表期刊：Fronts Plant Sci 2017.08 IF: 4.298
研究背景：
毛花猕猴桃是一种原产于中国的多年生二倍体木本植物，由于维生素C含量高且具有药用价值，被视为重要的商业猕猴桃品种。表达序列标签SSRs（EST-SSRs）不仅能揭示物种的适应性和环境的异质性，而且由于有较高的保守性，在不同物种间（同属内）也表现出较好的可转移性。
研究方法：
对来自4个野生群体的8个毛花猕猴桃的果实进行转录组测序以开发微卫星标记，测序平台为Illumina MiSeq。并用其中一个个体验证扩增特异性，用来自7个群体的186个个体进行遗传多样性和遗传结构研究。
研究结果：
通过转录组测序和从头组装产生69783个非冗余的功能基因，在7495个功能基因中共鉴定到8658个EST-SSR位点，利用183对引物进行PCR扩增，结果显示，有69个位点具有多态性，且其中61个位点能在至少一个物种中扩增成功（图2）。随机挑选14个位点进行遗传多样性分析，进化树和贝叶斯群体结构结果显示样本分为2个明显独立的亚群，与这些样本的地理分布一致（图3）。因此，该研究结果对于毛花猕猴桃遗传多样性的研究具有一定的指导意义。
图2 毛花猕猴桃功能基因注释及EST-SSRs的开发流程
图3 基于14个EST-SSRs的毛花猕猴桃进化树构建及群体结构分析
