2016-09-08
随着三代测序技术的成熟，得到了越来越多的科研工作者的认可。关于三代测序的文章数量，近年来不断地增长，很多发表在SCI的顶级期刊上，比如利用三代测序技术开展转录组测序，可获得mRNA的全长信息和基因结构信息，这类研究的文章影响因子基本是10分以上。说到这里，各位老师、学者们是不是已经按耐不住了呢？
今天小编就三代转录组测序的技术原理带领大家纵观全长转录组的时代！三代测序又称单分子实时测序技术（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指对 DNA 分子进行测序时，不需要经过扩增，实现对每一条 DNA 分子进行单独测序的技术。将三代测序应用在转录组测序中，可以真实反映动植物基因组结构信息，获得全长转录组。
众所周知，应用二代转录组测序技术，无论是有参考基因组还是无参考基因组，都需要拼接成一个完整的转录本，那么问题来了，二代测序下机的都是短片段，要得到原始的转录本信息，就需要对短片段进行拼接。通过PacBio所独有的环形一致性测序（Circular-consensus sequence，CCS）模式，可以极大地提高测序的准确率，一般而言，将序列循环测序5~6次后，获得的一致性序列的准确率可以达到99.99%（QV40）以上，远远超过了二代测序的准确率。
平台较量
加利福尼亚太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio）推出的三代测序平台主要有两大系列，即 RS 系列和 Sequel 系列。其中，RS II 系列于2013年4月份推出，通量为 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年9月份推出，该系列与 RS II 系列测序原理相同，但测序通量有了很大的提升，单个 SMRT Cell 的测序通量为 RS II 系列的 7 倍。目前，国内应用最为广泛的仍然是 RS II 系列。但是小编所在的公司派森诺生物已经订购了一台 Sequel。以下表格就是两大系列的对比：
二代、三代建库流程较量
而对于建库来说，三代也比二代分外简单，具体流程对比如下图所示：
图1 三代转录组测序建库流程
图2 二代转录组测序建库流程
从建库流程我们也可以看到，无需磁珠富集mRNA，三代转录组测序只要用随机引物将RNA样品进行反转录形成cDNA，再通过将cDNA跑E胶选择目的片度（如3K-5K），切胶回收后再进行一轮扩增、加环状接头后形成CCS，即可上机。（其中环状接头序列为5’–pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT– 3’前面绿色和后面蓝色反向互补，形成配对，中间序列成环，整个形成发卡结构。）一个文库对应一个SMRT Cell，单个 SMRT Cell 的运行时间为 2~6 h，每个SMRT Cell有15万个零模波导孔（ZMWs），不同片段长度的文库进入孔的效率不同，一般小片段文库进入孔的效率高；由于三代测序过程中无需扩增，因而避免了测序覆盖的不均一性，也没有GC 偏好性。
全长转录组测序小结
综上所述，基于三代测序平台RS II 和Sequel，技术上我们省时又省力，不论是RNA的总量（≥1μg）还是建库步骤，较二代的测序的流程都简明了很多；其次，我们可以得到转录组目标片段的全长以及转录本的表达量等信息，解决了扩增cDNA序列3‘或5’端的技术难题。目前关于三代测序的文章数量不断地增长，连同二代测序一起研究的文章也是不胜枚举，下一期我们就针对具体的文献，结合三代的分析再跟大家一起分享！
