2017-11-17
三代单分子测序一个十分重要的优势是能够同时获得基因组中的甲基化修饰信息。当基因组中某位点存在碱基修饰时，测序速度会变慢，Pacbio公司得出检测算法，可以识别m6A、m5C和m4C的甲基化修饰。近年来，甲基化研究热度居高不下。在细菌基因组中，N6-甲基腺嘌呤（m6A）和N4-甲基胞嘧啶（m4C）很常见，它们作为限制修饰（RM）系统的一部分行使重要功能。三代单分子实时（SMRT）测序技术的出现，为甲基化位点的定位提供了简单高效的方法，事实上，三代测序所能提供的甲基化信息远比我们想象中丰富。
分子生物学经典杂志《Nucleic Acids Research》（影响因子10.162）中刊登了一篇文章，通过对12株结核分枝杆菌（MTBC）进行三代测序，深度挖掘“精确甲基化”信息。
研究方法：
借助SMRT测序技术和二代亚硫酸氢盐甲基化测序，鉴定属于不同MTBC谱系的12种MTBC菌株的甲基化位点。通过数据库比对和分子生物学实验鉴定了3个m6A序列motif及其相应的MTase基因。此外，通过计算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每个甲基化修饰位点的甲基化状态和序列读取，获得MTBC菌株的精确甲基化信息。
测序平台：PacBio RS II&Illumina HiSeq
研究结果：
1、MTBC菌株全基因组甲基化状态（12株）
对12株菌基于三代数据进行甲基化分析，共找到3个甲基化motif。表格中统计的Motif数量包括在正链和负链上的甲基化数目，结果中可以看出，并非所有的motif序列都是被修饰的。
2、未甲基化motif在基因区(GR)和基因间区(IGR)区域的分布
研究人员总结了未甲基化motif在基因组当中的分布情况，表中括号中的数字表示半甲基化（一条链被甲基化）。结果显示，有相当比例的GATN4TAC未甲基化位点分布在IGR中，它们大多位于起始密码子上游50bp，而大多数的激活子位于起始密码子上游70~80bp处，因此这些位点保持未甲基化状态可能是为了保证有关基因顺利转录。
3、甲基化reads比例
以SMRT测序reads为研究对象定义公式：甲基化reads比例（The methylated-read ratio）=甲基化reads数/包含motif的reads数，结果如表中所示。由此定义了MTBC菌株的“精确甲基化”，“精确的甲基化”显示在具有活性MTase的MTBC菌株中存在未甲基化的基序位点。
4、MTase基因预测及MTase基因中的SNP/Indel位点分布
在REBASE数据库中比对预测得到MTBC菌株中3个有活性的甲基化基因——mamA、mamB、hsdM，并进行了分子生物学的鉴定。由于突变/缺失，MTase活性在12个菌株之间变化。通过检测MTase基因中的SNP/Indel位点分布观察到，大多数未修饰的位点与转录因子结合区重叠，可能保护了这些位点免受甲基化。
结论
使用SMRT测序技术，鉴定属于不同MTBC谱系的12种MTBC菌株的甲基化位点，以及3个m6A序列motif及其相应的MTase基因。此外，研究人员还通过计算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每个甲基化修饰位点的甲基化状态和序列读取，以获得MTBC菌株的精确甲基化信息，同时使MTase的复杂活性能够在全基因组测序中被分析。
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文章索引
Lingxiang Zhu, Jun Zhong, Xinmiao Jia, et al. Precision methylome characterization of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) using PacBio single-molecule real-time (SMRT) technology.Nucleic Acids Research,Jan 29;44(2):730-43
阅读原文链接：https://dx.doi.org/10.1093%2Fnar%2Fgkv1498
