2016-08-25
派森诺生物与武汉水产研究所、华中农业大学共同合作，在《Fish & Shellfish Immunology》（影响因子3.025）发表论文，对感染和未感染柱状黄杆菌的鳜鱼的头肾组织样本进行测序，探讨免疫相关基因的作用，为防治柱形病提供新思路。
一、研究背景
柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)为柱形病的病原菌，鱼类被感染后的主要表现包括鱼鳍破损、烂鳃和表皮溃疡，对水产业造成严重经济损失。鳜鱼是亚洲国家重要的经济鱼类，近年来鳜鱼柱形病发病率明显增加。本文探讨鳜鱼被柱状黄杆菌侵染后的基因表达调控机制，为防治柱形病提供分子基础。
二、材料
选取5月龄鳜鱼，平均体重68.5±12.1 g， 置于25-26℃淡水循环的系统里喂养。柱状黄杆菌在Shieh培养基培养，收集，浓度调整到5×108CFU/ml。
随机选取六条鳜鱼，腹腔注射137 ml 柱状黄杆菌，对照组则注射等体积的Shieh培养基。36小时后当注射柱状黄杆菌的鱼游动行为出现异常，立即取头肾组织并冻在液氮中。提取样本的总RNA，构建文库，利用Illumina HiSeq平台上机测序，并进行数据分析。
三、结果
1.感染组和未感染组间的差异表达基因及GO、KEGG富集分析
分析差异表达基因软件为DESeq，使用表达倍数差异和p-value筛选标准，结果得到1019个差异基因，包括603个上调基因和416个下调基因。
图1 差异基因的火山图和MA图
图2 表达差异基因的GO富集分析
图3 表达差异基因的KEGG富集分析
2.分析与免疫反应相关的差异的基因
在差异表达基因中找到27个与免疫相关的基因，包括17个上调基因和10个下调基因，这27个免疫相关基因的序列已被证实并列入NCBI基因数据库。
3.qPCR验证差异表达基因
为验证转录组测序的结果，随机挑选6个基因用于qPCR验证，两种实验模式下上下调的趋势一致。
图4 qPCR验证结果
四、讨论：
由于实验样本的鳜鱼头肾组织为免疫器官，下面针对17个上调和10个下调的免疫反应相关基因进行具体讨论。
1.细胞因子相关基因
细胞因子由大量的细胞产生，在免疫应答和造血系统中扮演重要角色。细胞因子绑定到特定的靶细胞的膜受体，触发信号转导通路，最终改变靶细胞的基因表达。
2.补体系统
补体系统是一个非常重要的先天免疫系统的一部分，它补充抗体和吞噬细胞清除受感染的生物的病原体。结果中3个补体因子是表达上调，包括C8α 和 C6β，表明感染FC的鳜鱼中经典的和备选的补体旁路均被激活，补体通路激活的细节还需在未来深入研究。
3.细胞凋亡
细胞凋亡是一个无处不在的过程，涉及到许多蛋白质和重要的是宿主清除病原体。结果中，细胞色素C (Cyt C) 和 CASP3表达上调，而热休克蛋白70(Hsp70)则表达下调，Cyt C和CASP3可以促进细胞凋亡。
4.激酶
感染FC后的鳜鱼中有两个激酶(AMPK和ZAP-70)表达下调，AMPK在细胞能量平衡中发挥作用，包括刺激脂肪酸氧化和抑制脂肪生成；ZAP-70是T细胞受体的一部分，在T细胞激活中扮演重要角色，随后促进T细胞分化、增殖和细胞因子分泌。而两个激酶下调的机制还需再研究。
5.铁代谢
值得注意的是，感染FC后的鳜鱼中铁调素的表达是未感染组的126倍，是免疫相关基因中差异最明显的。铁调素是由25-84个氨基酸构成的短肽，主要由肝脏产生，具有杀菌的性能，已有研究证明炎症状态下铁调素水平会升高。可见铁离子的调节是预防细菌感染的重要策略。
6.细胞信号蛋白激酶
细胞信号是调节细胞活动和协调细胞行为的一个复杂的基本通信系统。钙调蛋白(CaM)是一个小的、高度保守的蛋白质，通过结合钙离子能传感信号。SHC-转化细胞表面受体的蛋白质传输信号，如表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素受体。14-3-3蛋白是一类在所有真核细胞中表达的保守的调控分子，可以结合多种功能不同的信号蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体。鳜鱼感染FC以后SHC2表达下调，而Ca Ml-6 和 14-3-3表达上调，意味着处理组和对照组之间复杂的相关性。
参考文献
Zhou W, et al. Analysis of the transcriptomic profilings of Mandarin fish (Siniperca chuatsi) infected with Flavobacterium columnare with an emphasis on immune responses. Fish & shellfish immunology 43(1):111-119.
