2016-06-17
派森诺与中国科学院西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室共同合作，在《BMC Genomics》（影响因子3.867）发表论文，首次揭示了影响孩儿参二型花发育的网络调控机制。
1. 研究背景
孩儿参（拉丁名：Pseudostellaria heterophylla），又名太子参，是石竹科孩儿参属的一种；为多年生草本植物多年生草本，高15-20厘米。以根入药，有补气益血、生津、补脾胃的作用。孩儿参花期4-6月，分为开花受粉花和闭花受粉花，即在同一植株上既可生长出开花受粉花(chasmogamous,CH)，又可生长出闭花受粉花(cleistogamous, CL)。开花授粉是很多植物在开花后的一种授粉方式，闭花受粉是花朵在授粉期时与外界隔绝，即花在未开放时就完成了授粉，如豌豆。受季节和环境因素的影响，孩儿参生长CH和CL两种花型的能力也会随着变化，春天生长开花授粉花，夏天生长出闭花授粉花。大麦和水稻也是闭花受粉植物，研究表明，大麦中的闭花受粉基因Cly1是microRNA miR172作用的靶基因，miR172的定点突变会导致Cly1基因表达下调，进而抑制花朵浆片的生长才产生了闭花受粉花。孩儿参作为一种特殊的二态型闭花授粉植物，为研究开花受粉和闭花受粉的基因调控网络提供了很好的模型。然而在全基因转录组水平调控孩儿参两种花型产生的分子机制及调控浆片网络是怎样的，相关研究还很少。目前NCBI上还没有公布孩儿参的参考基因组序列，本研究对进一步完善其基因组信息也具有重要意义。
2. 研究目的
孩儿参开花受粉花和闭花受粉花开在不同的季节，受季节和环境因素影响较大，这些外界因素作用于植物机体会导致一些基因的表达量发生变化，如果这些变化的基因正是有关开花和闭花的，就会产生两种不同的花型。为了研究孩儿参开花受粉花和闭花受粉花中转录组水平的基因表达差异和影响这两种不同花型产生的基因调控网络，中国科学院西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室罗艳博士和她的团队对孩儿参进行了RNA-Seq研究。
3. 研究方法
本研究样本均采自山东半岛东南岸靠近东海的崂山上，开花授粉花采自四月份，闭花授粉花于五月份采集，每种花型包括3-5个不同生长阶段的花蕾。样本采集后均立即液氮冷冻，-80℃保存。提取总RNA后，通过安捷伦2100检测样品质量与完整性，使用Illumina TruSeq RNA sample preparation kit进行文库构建，并通过Hiseq2000平台上机测序。
图1 孩儿参两种不同花型（a-d:开花授粉花；e-h:闭花授粉花）
4. 分析内容与结果说明
4.1 序列拼接与unigene功能注释
通过RNA-seq无参转录组数据分析，序列拼接共得到44,603 unigenes，平均长度为860bp，具体拼接结果见表1。拼接得到的所有unigenes 与NR数据库比对，并对其进行GO, eggNOG, KEGG功能注释，其中eggNOG注释把所有unigenes分成了25类，在这些功能分类中，与信号转导相关的unigenes占8.01%，与转录相关的unigenes占5.91%，具体注释结果见图2。
表1 数据拼接结果
图2 eggNOG 功能注释
NR数据库比对结果还发现，孩儿参中与开花相关的基因有428个，这些基因参与开花时间的调控、花组织与器官的形成与发育等。
4.2 RNA-seq差异表达分析
差异基因分析结果显示在CH和CL两种花型中共有396个差异表达基因（差异基因筛选条件fold-change >4, FDR<0.05），其中有93个基因在CH花中表达上调，303个基因在CL花中表达上调。此外，分析结果还发现有3个转录本在CH花中特异表达，57个转录本在CL花中特异表达。进一步对差异表达基因进行GO富集分析发现大部分差异基因功能主要集中在对内源、外源刺激及外界环境胁迫的应答反应，这些功能也恰好解释了为什么CH和CL两种花会开在不同的季节。
图3 差异基因GO富集分析
注：蓝色代表CL花中上调基因，红色代表CH花中上调基因
4.3 qPCR验证
与开花调控网络相关的24个关键基因进行qPCR验证，其中差异基因FKF1, FT, STM, AP1, AP3, 和 PI 的RNA-seq与qPCR结果趋于一致；CRY2, PHY, CO, SOC1, AGL24等基因无表达差异，分析结果见图4。
图4 RNA-seq 与qPCR验证
4.4 两种花型基因调控网络分析
CH和CL两种花型分别生长在不同的季节，是外界环境的影响导致一些与开花相关的关键基因的表达发生了变化。在闭花授粉花生长时期，昼夜长短的改变导致FKF1表达量下调，光照质量变低导致FT基因表达量下调，二者低水平表达对延迟开花时间具有重要作用。另外，STM基因在花生长发育过程中具有调节花型、节间生长以及腋生分生组织的作用，并可促进花组织分裂相关基因AP1的表达上调。在上游基因的作用下，与花瓣和雄蕊生长相关基因AP3和PI的表达量下调，最终导致闭花授粉花的形成。两种花型的基因网络调控关系见图5。
图5 CH和CL花型基因调控网络分析
注：空白格代表基因表达量不发生变化，红色代表表达量上调，绿色代表表达量下调；箭头表示促进，垂线表示抑制
5. 结论
本研究表明孩儿参两种不同花型的产生是受不同季节外界环境的影响，外界环境的作用导致机体内与开花相关的一些关键基因（FKF1, CO, FT, STM, AP1,AP3,PI等）的表达发生了变化。通过基因之间的网络调控作用，最终与花瓣和雄蕊生长相关基因AP3和PI的表达受到抑制，形成闭花授粉花。另一方面也说明孩儿参二型花的产生是为了更好的适应外界环境，为研究闭花授粉植物提供了很好的模型。
参考文献
Luo Y, Hu J, Li L et al., Genome-wide analysis of gene expression reveals gene regulatory networks that regulate chasmogamous and cleistogamous flowering in Pseudostellaria heterophylla (Caryophyllaceae). BMC Genomics (2016) 17:382
