2016-06-01
【引言】
小编在刚接触三代测序时，深深地被它的超长读长所吸引，非常兴奋。这种兴奋没持续多久，原因是小编是一个技术控，大脑中马上跳出一连串的疑问（相信各位读者也存在类似的疑问）：三代测序的单碱基准确率很低，用这么低准确率的数据进行拼接拿到的结果靠不靠谱？三代测序的拼接算法不成熟，我拿到三代数据怎么拼？三代测序的成本很高，我能承受得起吗？后来，随着小编对三代测序的深入了解，发现我担忧的这些都不是事！不是事！不是事！
接下来，小编就来给大家普及一下三代测序的基本知识。
【何为三代测序？】
三代测序又称单分子实时测序技术（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指对 DNA 分子进行测序时，不需要经过扩增，实现对每一条 DNA 分子进行单独测序的技术。
【三代测序的技术阵营？】
三代测序根据其技术原理主要分为两大阵营，基于单分子荧光信号及基于纳米孔电流信号进行测序，代表公司分别为 Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore。目前，Pacific Biosciences 公司推出的三代测序仪在国内市场接受度和应用广泛。
【PacBio 为何能实现单分子超长测序？】
PacBio的单分子超长读长主要归功于两项重大发明专利技术：
其一：零模波导孔技术（Zero-Mode Waveguides，ZMWs）。该专利的设计灵感来自于微波炉门，简单来说就是设计一个孔径非常小的纳米孔，光仅能照亮固定了单个 DNA 聚合酶/模板分子的纳米孔底部。该发明专利能.大限度地降低背景荧光信号噪音，使单分子的荧光信号检测成为可能；
其二：核苷酸标记方法。传统的一代、二代测序均是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入到 DNA 链中。这些大分子的荧光染料影响 DNA 聚合酶的活性，造成聚合反应的提前终止。PacBio 的荧光标记连接到核苷酸的磷酸基团，荧光标记会随着 DNA 链的延伸而自动脱落，所形成的 DNA 分子为天然的 DNA 链。
【PacBio 测序平台？】
PacBio 公司推出的三代测序平台主要有两大系列，即 RS 系列和 Sequel 系列。其中，RS II 系列于2013年4月份推出，通量为 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年9月份推出，该系列与 RS II 系列测序原理相同，但测序通量有了很大的提升，单个 SMRT Cell 的测序通量为 RS II 系列的 7 倍。目前，国内应用.为广泛的仍然是 RS II 系列。但是，据小编所知，很多公司都在积极引进 Sequel 测序系统，国内订购的 Sequel 系统数量已经接近 10台。小编所在的公司派森诺生物也已经订购了一台 Sequel，该平台预计会在 5 月份发货，6月份进行装机。
【PacBio 测序优势？】
1、超长读长，平均 Reads 长度超过 20 kb，.长读长超过 60 kb；
2、无需经过扩增，避免测序覆盖的不均一性；
3、无 GC 偏好性；
4、测序速度快，单个 SMRT Cell 的运行时间为 2~6 hr；
5、直接获得碱基的修饰信息，如甲基化修饰；
6、一致性准确率高，30× 的测序深度拼接得到的单碱基一致性准确率可达到99.999%。
【PacBio 测序模式及其应用？】
三代测序模式主要有两种，即标准模式和环形一致性测序模式（circular-consensus sequence，CCS），这两种模式的目的及应用范围均不同。
标准测序模式的主要目的是为了获得长片段序列，主要应用于基因组从头测序、全长转录本测序等；
CCS测序模式的主要目的是为了获得稀有突变信息，主要应用于16S 宏基因组测序、低频率的异质性序列获取等等。
