2017-12-20
简介
OsABF1是bZIP转录因子，使用杂合转录因子（HTF）的方法与转录因子激活剂VP64（ABF1V）或转录因子抑制剂4EAR（ABF1E）融合，过表达转基因株系显示出明显不同的耐旱表型。通过对转基因水稻品系进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）测定，确定OsABF1与含有ACGT核心基序的DNA序列结合。经过分析RNA测序和染色质免疫沉淀测序数据之间的重叠，鉴定了涉及干旱反应多个方面的242个OsABF1靶基因。过表达这些基因之一的COR413-TM1（其编码推定的类囊体膜蛋白）导致耐旱表型，没有明显的副作用，在开发耐旱作物方面具有潜在的效用。
ChIP-seq：2组样本（WT植物和ABF1V-1转基因株系），4周龄水稻幼苗。
RNA-seq：4组样本（WT植物、ABF1V-1和ABF1E-1转基因株系、干旱处理的WT-D），4周龄水稻幼苗，其中WT-D组进行4小时PEG处理。
平台：Illumina HiSeq 2000
1.通过分析ChIP-seq数据鉴定ABF1V结合位点
鉴定了3882个定位于启动子或CDS区域的结合峰的基因，64.7％的OsABF1结合位点位于启动子区域（图1A）。TSS距离计算显示TSS上游200bp内的缔合位点的富集（图1B）,对OsABF1结合序列的分析检测到ACGTG（G / T）（C / A）共有序列的过度表达（图2C）。
图1 ChIP-seq ABF1V结合位点鉴定
2. RNA-seq的差异表达分析和聚类分析热图
差异表达分析显示：ABF1E株系中上调和下调基因的数目分别是171和818，ABF1V株系中上调和下调基因的数目分别是1550和2255，WT-D中上调和下调基因的数目分别是3596和4089。为了找到与OsABF1 HTF转基因系的异常表型相关的基因，将DEG分为七组。在ABF1V株系的1550个上调基因中，117个在ABF1E株系中下调；在WT-D中，这117个基因中超过75％也被上调。聚类分析表明ABF1E株系与WT分在一个组，但是ABF1V株系更接近WT-D。
图2 RNA-seq差异表达分析热图
图3 RNA-seq聚类分析热图
3. RNA-seq和ChIP-seq数据之间的Venn图重叠分析
ChIP-seq得到的与ABF1V 关联的3882个基因，通过Venn图重叠分析发现在ABF1V株系和WT-D中有242个OsABF1结合基因被上调。这些基因被认为是OsABF1直接调控干旱胁迫下的候选靶基因。
图4 RNA-seq和ChIP-seq重叠分析Venn图
4. RNA-seq和ChIP-seq聚类分析及靶基因COR413-TM1的选定
聚类分析显示与OsABF1相关而受干旱胁迫影响的基因都丰富了在与膜，运输，氧化还原过程，代谢，转录因子活性，激酶活性，磷酸酶活性，应激反应有关的途径中。根据转录本与富集的途径的关系以及qRT-PCR和ChIP-qPCR，又选出了7个候选基因。这7个基因都在应激反应功能分类中高度富集，干旱条件下上调，在ABF1V株系上调，在ABF1E株系中下调。其中一个候选基因是OR413-TM1，被确认是OsABF1的直接靶基因，且其超表达实验表现出耐旱表型。
图5 RNA-seq和ChIP-seq聚类分析图
参考文献：
Zhang C,Li C, Liu J,Lv Y,Yu C,Li H,Zhao T,Liu B. The OsABF1 transcription factor improves drought tolerance by activating the transcription ofCOR413-TM1 in rice.J Exp Bot. 2017 Jul 20;68(16):4695-4707.
