2018-01-17
期刊：Developmental and Comparative Immunology
影响因子：3.217
ROS（reactive oxygen species,ROS）是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇。中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。随着自由基生物学研究的发展，研究者们逐渐认识到ROS 可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，并发现了自由基与细胞信号转导之间的内在关联。它能使造血祖细胞分化，并在造血细胞的命运调控中发挥着重要的作用。在此篇文章的研究中，利用离子激流质子测序平台（Ion Torrent Proton sequencing platform），对中华绒螯蟹的造血组织（HPT）和血细胞进行了转录组测序，寻找与造血功能相关的潜在的信号通路；筛查成熟血细胞的潜在的分子标记以及挖掘ROS在造血功能中的作用、分子基础和调节机制。
实验对象：中华绒螯蟹
实验方法：
1) 对HTP和血细胞进行转录组测序和QPCR验证
2) 对HTP和血细胞中的ROS进行测定
3) 对HTP细胞的吞噬能力进行流式检测
4) 注射NAC和嗜水气单胞菌后测定ROS和血细胞总数（THC）
实验结果：
1. 通过对HTP和血细胞中的ROS比较和对HTP细胞的吞噬能力的研究，探索ROS在HTP细胞增殖和分化过程中的作用
图1 ROS和吞噬作用的流式检测结果
氧化还原系统在维持干细胞的自我更新和分化方面起着重要的作用。活性氧(ROS)是由氧代谢产生的，在许多过程中，如癌症、心血管疾病和衰老，都被牵涉其中。越来越多的研究揭示了ROS在血液生成中重要的调节作用。HPT和血细胞中通过流式细胞仪均检测到ROS阳性信号，但是HPT中ROS的阳性率明显高于血细胞（如图1A和1C）。HPT细胞对于直径为2μm的乳胶微球的吞噬能力为8.2%（如图1B）。HPT细胞具有吞噬细胞的能力被证明，这表明在成熟前，血细胞前体细胞可能发生了功能性分化。
2. 通过对HPT和血细胞转录组数据比较，研究血细胞生成机制和开发潜在的分子标记物
表1 转录组测序比对统计
表2 两组中差异表达基因数目统计
图2 HPT和血细胞GO注释
图3 差异表达基因富集分析
对HPT和血细胞进行转录组测序，得到如表1和表2所示数据。对测序后的数据进行GO注释（图2）HPT和血细胞比较，共有362个差异表达基因（图3），其中301个在HPT中上调，61个在血细胞中上调。 这三百六十二种不同表达的基因，其中一些可能是HPT和血细胞的标志性分子。301个在HPT中上调的基因成功富集到50个KEGG信号通路上，例如嘌呤代谢，嘧啶代谢，赖氨酸生物合成，组氨酸代谢，花生四酸代谢，脂肪酸生物合成，柠檬酸循环(TCA循环)和氧化磷酸化等。61个在血细胞中上调的基因主要富集到了七个KEGG通路，其中一个是酪氨酸代谢途径，这表明了在血细胞中有独特的酚氧化酶激活系统。此次的转录组数据为进一步研究血细胞生成机制和开发潜在的分子标记物提供了资源。
图4 HPT和血细胞32个差异表达基因QPCR分析
如图4所示，HPT和血细胞32个差异表达基因可分为DNA、RNA和蛋白合成，细胞分裂，线粒体和能量代谢，酚氧化酶激活系统和其他五类。这一结果也符合造血干细胞在分裂和分化过程中需要大量的DNA、RNA和蛋白质。对这些基因进行QPCR验证，结果和转录组测序结果一致。
3. 通过注射NAC探究ROS对HPT造血功能的影响
NAC是一种ROS清除剂，在NAC刺激12h和24h后，HPT细胞中ROS的含量等级明显下降（图5A）。使用CCK8方法检测NAC注射24h后HPT细胞的细胞活力，图5B中明显可以看出NAC组细胞活力显著下降，并且图5C中可以看出注射NAC12h和24h后，血细胞总数明显下降,表明NAC抑制HPT细胞增殖。
图5 NAC对HPT细胞中ROS、细胞活力和THC的影响
图6 注射生理盐水，嗜水气单胞菌以及嗜水气单胞菌和NAC对THC的影响
为了进一步证明ROS和造血功能之间的关系，对120只中华绒螯蟹随机分成3组，第一组注射生理盐水，第二组注射嗜水气单胞菌，第三组注射嗜水气单胞菌和NAC，然后统计THC的值。图6表明注射NAC可以抵消注射嗜水气单胞菌导致的THC增加的效果，使其恢复正常值。总结就是：经NAC对ROS进行了清除后，HPT细胞的相对存活能力显著降低，同时，红细胞总数也减少。更重要的是，NAC可以显著降低由细菌刺激引起的血细胞总数的增加。这些结果共同证明了ROS信号对血细胞释放的重要性。
参考文献：
Jia, Z., Wang, M., Wang, X., Wang, L., Qiu, L., & Song, L. Transcriptome sequencing reveals the involvement of reactive oxygen species in the hematopoiesis from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis. Developmental & Comparative Immunology. doi: https://doi.org/10.1016/j.dci.2017.12.030
