2018-02-23
对于土壤微生态系统而言，通过功能基因对微生物群落进行扩增子测序分析，是探讨土壤微生态作用机制的常用方法。最近，派森诺生物再次与石河子大学合作，在《Science of the Total Environment》（影响因子4.900）上发表文章，揭示化学和有机肥料的使用对滴灌石灰土中N2O气体排放和反硝化细菌群落的作用。
1 研究背景
N2O是一种强效的温室气体，破坏臭氧层。大气层N2O的含量的增加很大程度上和农业耕作方式相关。大约58%的人为N2O的排放来自于农业，在2030年很可能会因为N肥和动物肥料的施用N2O含量提升35-60%。反硝化作用是形成N2O的主要生物地球化学途径，这个过程被4种关键酶催化：硝酸还原酶（NAR），亚硝酸还原酶（NIR），一氧化氮还原酶（NOR）和一氧化二氮还原酶（NOS）。编码NIR和NOS的基因往往会通过相应的功能基因来分析反硝化菌群。
本文研究目的是为了确认不同施肥方式引起的土壤参数变化和反硝化菌群之间的潜在联系。以滴灌棉花产业系统中石灰土为材料，连续4年施用化学肥料或者化学肥料加有机肥，从而比较化学肥料和混合有化学肥料的有机肥料对N2O通量的影响，并探究有机肥混合化学肥料如何影响土壤反硝化细菌的丰度，群落组成结构和多样性，揭示N2O产生、反硝化细菌基因群落丰度和土壤物理化学性质之间的关联关系。
2 研究方法
测序技术：Roche 454 FLX平台
测序模式：nirK、nirS和nosZ功能基因测序
实验设计：
| 实验对象 | 处理方式 | 组名 | 样品数 |
滴灌石灰土 | 未施肥 | CK | 3 |
化学肥料施肥 | CF | 3 | |
60% 化学肥料+牛粪 | COM | 3 | |
60% 化学肥料+生物肥料 | CBF | 3 |
3、研究结果
3.1 土壤中N2O通量
数据分析发现，施肥方式显著影响土壤中N2O的通量（图1）。按照N2O平均通量逐渐下降的顺序进行排序发现：CF>COM>CBF>CK。土壤中N2O通量通常在灌溉施肥后的前3-4天增加，随后就会减少。CF中平均最大N2O排放量比COM和CBF分别高了29.1%和40.1%。同时发现N2O通量在CF中比COM和CBF减少更快。结果表明N2O通量在施肥后急剧变化，有机改良剂降低了N2O排放的峰值，但是随着时间推移会释放更多N2O。
图1 棉花种植期间不同施肥模式下N2O通量统计图
3.2 累积的N2O排放和N2O排放系数
和未施肥组相比，CF,COM和CBF处理组中累积的N2O排放是显著偏高的（图2）。CF组中累积的N2O排放要比COM和CBF处理组高3.65%和8.29%。排放系数（EF）值在CBF中要明显比CF和COM组中要小，表明生物肥料减缓土壤中N2O排放，但是会比有机肥排放的更多。
图2 不同施肥模式下土壤N2O排放和N2O排放系数
3.3 反消化酶活性
施肥组相比CK组，明显增强了NAR，NIR和HyR的活性（图3）。其中，CBF组通常拥有最高的酶活性，而在CF组中是最低的酶活。CBF和COM组中NAR和NIR的活性更高，但是HyR活性没有明显区别。结果显示有机肥，特别是添加生物肥料之后，可以增强反硝化酶的活性。
图3 不同施肥模式下反硝化酶活性统计分析
3.4反硝化基因丰度
和未施肥组相比，三种施肥处理明显增加了nirK基因的数量。CF组nirK拷贝数最高，比CBF组和COM组分别高36.5%和20.9%（图4）。但是，CF组中nirS和nosZ的基因拷贝数并没有发生显著变化。结果显示施肥处理对三种类型的反硝化基因的丰度有不同影响。另外发现，NIR是和nirS而不是nirK亚硝酸还原酶基因的丰度有密切关联。
图4 nirK-、nirS-和nosZ型反硝化菌群的丰度及NIR活性和nirS或者nirK拷贝数之间的关系
3.5 与土壤理化性质的关系
冗余分析用来检测之土壤理化性质，反硝化细菌群落丰度和反硝化酶活性之间的相互关系（图5）。顺着轴1看CF及CK处理组，发现很大程度上和COM及CBF处理组分的很开。可以看出，反硝化菌群的丰度和SOC，NH4+，NO3-和WHC呈现正相关，和MBC/MBN，pH呈现负相关。NirS的丰度明显和nirK和nosZ型硝酸盐还原酶基因拷贝数成正相关。反硝化酶活性和NH4+，SOC，NO3-呈正相关，和pH，MBC/MBN是负相关。总之，结果表示NH4+，SOC，NO3-和土壤pH显著影响反硝化酶活。还有，自动线性建模表明nirS型反硝化菌群，土壤SOC，NO3-和pH是和土壤N2O的排放相关的主要影响因子（图6）。
图5 反硝化菌群丰度与反硝化酶活和土壤生态因子之间的冗余分析
图6 自动线性建模预测分析反硝化基因丰度的重要性和挑选影响N2O排放的土壤理化属性
3.6 反硝化细菌群落的丰度和多样性
四组样本测序共获得195,904条nirK序列，183,441条nirS序列和375,839条nirK序列。CBF组中序列数量最多，随后是COF，CF和CK。施肥增加了反硝化细菌相关的OTUs的丰度（用chao1和Ace评估）。CBF中nirS和nosZ的丰度要高于其他施肥处理组，也显著高于对照组。但是施肥并没有显著影响nirK的Simpson和Shannon指数。COM和CBF组中nirS和nosZ的α多样性要高于CK和CF组。结果表明有机肥料结合化学肥料显著增加了nirS和nosZ的多样性，而不包括nirK的多样性。
3.7 反硝化细菌群落结构（热图）
施肥方式显著影响了反硝化细菌群落的基因型变化（图7）。NirK型反硝化菌群组成在COM和CBF中是相似的，但是和CK和CF相比是有显著差异的。同时nirS型反硝化菌群组成在COM和CBF中也是高度相似的，有着相同的优势OTUs。而且NosZ基因中也有相同趋势，CK和CF组总nirS和nosZ型群落几乎是重叠的。总之，有机肥料导致nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌群落结构发生巨大变化。
图7 相对丰度top30微生物属聚类热图分析
4、总结
有机改良剂（例如牛粪和生物肥料）的施用，减少了累积N2O的排放，降低了排放系数，同时增加了反硝化酶活性。研究结果表明，土壤中N2O的排放主要是和nirS型反硝化细菌的丰度、土壤有机碳（SOC）和NO3-相关，而反硝化细菌群落的变化和SOC、NO3-、NH4+、持水力和土壤pH密切相关。总之，有机肥料增强了反消化酶活性，增加了反硝化细菌基因的拷贝数，但是减少了N2O的排放，同时发现nirS和nosZ型反硝化细菌群比nirK型反硝化细菌群对有机肥料更敏感。
本研究亮点：
1、NirS和nosZ菌群不受化学肥料而受有机肥料的影响；
2、SOC、NO3-、NH4+和pH是促进反硝化细菌群落丰度发生变化的主要影响因子；
3、影响N2O排放的重要因素是nirS菌群、SOC和硝酸盐；
4、生物肥料和有机肥料同时使用可以显著降低N2O的排放。
参考文献
Tao R, Wakelin S A, Liang Y, et al. Nitrous oxide emission and denitrifier communities in drip-irrigated calcareous soil as affected by chemical and organic fertilizers [J]. Science of the Total Environment, 2018, 612:739.
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