2018-06-11
第三代测序技术是指单分子测序技术。与二代测序相比，三代测序不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。由此可见，不依赖于PCR的三代测序对原始投入DNA的质量和总量要求是很高的。另外，第三代测序还可以进行全长16s/18s测序、扩增子和全长转录组测序。当然，三代测序平台还可以做其他很多事情，在此就不一一赘述啦！
为了解决老师对三代基因组、多样性和全长转录组测序样本和DNA或者RNA相关要求的疑问，方便实验的展开，我们专门总结了常见样本和核酸的送样要求以及标准。对于一些没有提及到的样本类型可以咨询我们的销售哦~
基因组测序样本主要包括原样和DNA两种类型。原样主要有微生物（细菌和真菌）、动物组织、血液样本、植物组织等。一般情况下，只需要满足下列要求就可以啦!
微生物菌体（适用于细菌、酵母菌和霉菌等）
培养情况
对数期
常规菌体： OD600 = 0.4~0.8
多糖或次生代谢物较多的菌体： OD600 = 0.4~0.6
菌体收集
离心收集
离心条件： 温度为 4℃， 转速 ≤ 10000 rpm/min， 时间 ≤10 min
菌体洗涤
离心倒掉培养基后，用 1x PBS 缓冲液清洗1-3次（培养基要洗干净），然后离心收集菌体，弃尽缓冲液，随后迅速置液氮冷冻，-80℃保存，干冰运输
动物组织
动物组织建议选择核酸含量较高、成分简单且容易研磨的部位，比如肌肉组织。不建议送骨、角、壳和毛发等核酸含量少且不易研磨提取的部位。以下是取样建议：
新鲜的组织
组织取下后应迅速置液氮冷冻，-80℃保存，干冰运输
避免反复冻融
植物组织
植物组织主要分为根、茎、叶、花、果实和种子等。相信大家都倾向于送叶片吧！一般情况下，幼叶所含的次生代谢产物（含氮有机物、萜类化合物和酚类化合物）相对较少，相对茎、种子和果实等其他部位所含DNA量更多，提取起来更加容易成功! 以下是一些取样建议：
幼叶或者嫩叶
叶片表面无水分和可见杂质
叶片取下后应迅速置液氮中冷冻，-80℃保存，干冰运输
避免反复冻融
血液样本
采集新鲜的血液于含有EDTA的抗凝管中，
常温3000rpm/min 离心15min，弃掉上层血浆，
将下层血细胞分装到EP管中，迅速放置-80℃冷冻保存，干冰运输
避免反复冻融
下面要关心的问题是送多少合适？送一火车？没必要，请看下表：
物种名 | 正常一次提取需要的量 |
革兰氏阴性细菌 | 菌体湿重1.5g |
革兰氏阳性细菌 | 菌体湿重2g |
植物组织 | 嫩叶鲜重5g |
小型真菌 | 菌体、菌丝和孢子粉等 湿重2.5g |
大型动物 | 肌肉组织鲜重5g |
小型动物 | 动物体累计鲜重3g |
昆虫 | 正常体型3g |
血液（抗凝） | 哺乳动物血液10ml,非哺乳动物血液5ml |
… | … |
为保证实验能短时高质完成，我们建议老师送三次提取的用量~
以上就是基因组测序取样的主要注意事项啦！话说，取样完了就该送样了~其实吧，送样比较简单，一般情况下，准备足够大的泡沫箱（隔热效果好）和足够量的干冰，一把剪刀一卷胶带就好啦!要保证运输过程中干冰别蒸发完了（多加点干冰并且密封好）！
原样说完了，简单说一下送样为DNA的一些要求
1. 总量：20K文库需要60μg，40K文库需要200μg（由于收到DNA溶液后我们会进行磁珠纯化提高纯度，根据DNA溶液的纯净度会有20-80%的损耗，DNA里面杂质越多损耗越大，总量是否合格需根据纯化后的结果判定）
2. OD值：260/280=1.8-2.0， 260/230=2.0-2.2；
3. 紫外浓度/荧光浓度<2；
4. DNA完整度：无降解，主带>50kb；
5. DNA样本溶于Buffer EB中（QIAGEN, 250 ml Elution Buffer 货号：19086）；
6. 电泳检测无RNA污染；
7. 物理化学性质正常，即DNA溶液为无色、透明、不粘稠和无荧光染料的液体状态；
8. 避免紫外照射，不可反复冻融，不可存放于高温状态，不可存放于极端PH溶液中（PH<6或PH>9）
以上是基因组测序的送样要求，接下来我们要聊聊多样性的送样要求啦，篇幅较长，但都是知识点，请各位老师耐心阅读~
样本获取及制备（多样性篇）
原样类
粪便样品
取样时避免尿液和水体污染，用粪便取样勺等截取粪便样品中段里部（粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，外部容易污染，且接触空气后，部分细菌DNA开始降解），保存在无菌的2.0ml离心管中，每管0.5-1.0g样品，每个送三份，并做好标记，-20℃冰箱冻存，足量冰袋运输。
肠道内容物
取出整个肠道，切取所需肠道内容物（有条件的可以在超净工作台中操作），用无菌手术刀刮取或者镊子挤出内容物，保存在无菌的2.0ml离心管中，每管0.5-1.0g样品，每个送三份，并做好标记，-20℃冰箱冻存，足量冰袋运输。
土壤样本
挖取地下5-20cm的土层，去除可见杂质，保存在无菌的2.0ml离心管中或者小自封袋中，每份0.5-1.0g样品，每个送三份，并做好标记，-20℃冰箱冻存，足量冰袋运输
水体样本
将水样通过滤膜进行过滤，过滤后微生物会截留在滤膜上，用0.45μm孔径的滤膜，富集真菌类或者体积更大的生物，用0.22μm孔径的滤膜，富集细菌或者体积更大的生物。每个样本过滤出三份滤膜并做好标记，-20℃冰箱冻存，足量冰袋运输。
DNA 检测样品
1. 基因组DNA
1） 体积大于20μl
2） DNA样本溶于buffer EB（QIAGEN,250ml Elution Buffer 货号：19086）。
3） 电泳检测无RNA 污染
4） 由于微生物样本的特殊性，样品是否合格，以最终扩增结果为准。
2. PCR产物
1） 体积大于20μl，浓度大于10ng/ul
2） 条带单一，无非特异杂带
3） 凝胶电泳时不能使用EB（溴化乙锭），建议使用SYBR ®Safe DNA Gel Stain （Invitrogen ，货号：19086）
4） 不能太长时间暴露在紫外线下
5） 回收好的PCR产物溶于buffer EB（QIAGEN,250ml Elution Buffer 货号：19086）
6） 物化状态正常：样品无色，透明，纯净无杂质不粘稠，无荧光染料等污染
7） 避免紫外照射，避免反复冻融和高温存放，避免存放在偏酸或者偏碱溶液中（PH<6或者PH>9）。
最后就是全长转录组的送样要求啦，详细如下~
样本获取及制备（转录组篇）
全长转录组测序送样也主要包括原样和RNA两种类型，由于我们身边的RNA酶太丰富了，且性质十分稳定，不容易被破坏，因此RNA的取样需要更注意一些细节。
I取样实验前处理
1. 组织取样部位要正确，并剔除与研究无关组织部位的影响，争取实验组和对照组的取材时间，部位等方面保持一致；
2. 保证取样的过程和使用的器械，容器，试剂均没有RNA酶污染；
3. 实验前分别用酒精和蘸RNAzap的无纺布擦拭工作台面，需要用的器械等，这一步很重要呦；
4. 实验全程需佩戴一次性口罩和乳胶手套，实验过程中勤换手套。
II取样实验（已经取好的样品切忌反复冻融）
动物组织
解剖活体特定组织样本2g，用无酶水（每取样一个换一次，避免污染）快速涮干净表面血液（动作迅速），放入无RNase离心管（建议用专门的冻存管）中，拧紧盖子，放入液氮中冷冻15分钟，取出离心管放入写好样品信息的自封袋中，放在-80℃冰箱保存，干冰运输。
该送样要求适用于多数RNA丰度较高的组织，针对丰度较低的组织需要加大送样量，具体组织RNA丰度见下图（供参考）
细胞
贴壁细胞：在显微镜确认细胞的完整性（破裂细胞会释放RNA酶降解RNA）,使用预冷的1*PBS清洗贴壁细胞两次，加入适量的TRIzol（Invitrogen 货号：15596018），使用移液器充分吹打使细胞裂解，将细胞裂解液转移至1.5ml无酶管中，-80℃保存，干冰运输。
悬浮细胞：选取生长对数期的细胞悬液，200g离心5min，去上清，加入适量1*PBS清洗两次，加入适量的TRIzol（Invitrogen 货号：15596018），使用移液器充分吹打使细胞裂解，将细胞裂解液转移至1.5ml无酶管中，-80℃保存，干冰运输。
细胞总量要求：5-10×107个，请提供三次所需用量。
血液（切忌反复冻融，取样到样品提取最好不要超过15天）
全血：取新鲜血液1ml于含EDTA的抗凝管中，混匀，用移液器分装到无酶的1.5ml离心管中，每管250ul，加入750ul TRIzol LS（Invitrogen 货号：10296010），混匀，液氮冷冻15min，-80℃冰箱保存，干冰运输。
血浆：将使用抗凝管所得的血浆分装入1.5ml的离心管中，每管1ml，液氮冷冻15min，-80℃冰箱保存，干冰运输。
总量要求：请提供三次所需用量
植物组织
尽量选取植物新鲜，幼嫩，生长旺盛的组织部位2g，擦净表面灰尘和杂质，迅速放入已经写好编号的螺纹冻存管中，液氮冷冻15min，-80℃冰箱保存，干冰运输。
细菌，真菌
取2ml对数期的菌液于无酶管中，4℃，1000rpm，2min，去除上清，（菌体过老或培养基残留会严重影响提取结果），液氮冷冻15min，-80℃冰箱保存，干冰运输（有毒性、致病性和传染性的样品千万不要寄送哦~）。
RNA样品
RNA样品需装在无酶的1.5ml离心管中，物化状态正常：无色，透明，纯净无杂质的液体。浓度＞300ng/ul，总量大于5ug（单次建库所需用量），请准备三次所需量，2100检测RIN值≥8.0，RNA检测结果(是否符合后续实验)以实验室实验报告为准。
以上就是这次介绍的所有内容啦，期待下次再见~
