2018-09-11
我们在前期通过一篇研究人体EccDNA（染色体外环状DNA）的文章，介绍了什么是EccDNA与CircDNA-Seq，以及它的研究材料和研究内容概况，这里我们来详细展示一下这篇文章的研究流程与发现。
1、EccDNA提取与测序
根据芽殖酵母Circle-Seq EccDNA的方法优化人体组织中真核生物EccDNA的纯化。
注：T1-T16：肌肉组织样本；B1-B16：血液样本；B6A-D，B14A-D：为测试线粒体DNA去除步骤中内切酶之间的差异。T2，T7深度测序以检测测序饱和度。
2、EccDNA测序数据分析
3、EccDNA研究结果
EccDNA在健康的人体组织和血液中很常见，其大小足以携带一个或几个完整的基因。我们发现EccDNA具有转录活性，认为EccDNA通过全长和/或基因片段的表达促使产生表型变异。主要结果如下：
3.1 基于Circle-Seq方法的EccDNA比对
总共检测到来自肌肉样本的43,460个hconf EccDNAs，81,066 个conf EccDNAs和13,655 lowq EccDNAs（每个样本106个细胞核）。在白细胞中，总共检测到6,253个hconf EccDNAs，3,191个conf EccDNAs和784个lowq EccDNAs（每个样本104个细胞核）。有130个EccDNA被定位到0.3Mb的TTN基因。注：Reads覆盖率＜95%被定义为低质量（lowq），reads覆盖率＞95%的EccDNA，相对于相等长度的相邻区域的总覆盖范围，平均覆盖率高于2倍的被定义为hconf，低于2倍的定义为conf。
3.2 质粒和重复序列上的EccDNA大小与reads分布
从16个肌肉样本中鉴定出138,027种不同的EccDNA。所有染色体均以EccDNA序列表示，其组合长度为人类基因组的12.6％（389.5 Mb）。使用在EccDNA纯化之前添加到肌肉和血液样品中的内部质粒对照测量Circle-Seq的灵敏度，Circle-Seq在每个细胞核的4kb范围内可检测到1-250个EccDNA。
3.3 EccDNA断裂点的基因组分布
大多数EccDNA（99％）小于25 kb，而剩余的1％来源于断裂点则超过了25 kb。超过一半的EccDNA来自基因或假基因区域（血液55％，组织52％）。
3.4 EccDNA 验证与DNA 缺失
通过Sanger测序验证了所有测试的EccDNA中的85％（20个中的17个），特异EccDNA来自基因间和基因位点。例如，[ERBB2circle exon 1-7]，其中包括ERBB2的前七个内含子和外显子。另外在DAZ4基因中，在[DAZ4circle exon 18]形成的精确位点发现DNA缺失。在血液和肌肉样品中，还检测到来自经常发生大量DNA缺失的基因位点的EccDNA，例如HLA（5 Mb，6p21.32-p22.1），KIR（1 Mb，19q13.42）和SERF1A_SMN2（2.5 Mb，5q13.2）。这些发现表明，大量DNA缺失可导致健康人体细胞中的EccDNA产生。
3.5 与染色体、基因密度和转录有关的EccDNA频率
EccDNAs的基因组分布显示，富含基因的17和19号染色体每Mb产生的EccDNA数目分别比其他染色体高出了1.7倍和2.9倍。另外，发现EccDNA/Mb与编码基因/Mb的比率之间存在正向关系，该结果表明编码基因的转录或其他特征影响了EccDNA形成的频率。
3.6 来自[HIP1circle exon 1]的EccDNA的转录本
为了研究EccDNAs是否被转录，筛选了肌肉组织中的mRNA序列，这些序列可以与检测到的EccDNA接合点的转录事件相匹配。从8名参与者的肌肉样本中鉴定了25种不同EccDNA的接合点转录本。样品中的EccDNA转录本证实了EccDNA的存在，例如，在五个参与者中，我们检测到TTN基因的分离转录reads，其与检测到的[TTNcircle]坐标匹配，其中一个大小为612,228bp。检测到T8样品中18kb [HIP1circle exon 1]的EccDNA坐标与来自T8的Huntington interacting protein 1的第一外显子的mRNA转录之间的完美重叠。
参考文献：
Henrik Devitt Møller, Marghoob Mohiyuddin, Iñigo Prada-Luengo, M. Reza Sailani, Jens Frey Halling et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9: 1069.
2018/9/11
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