2018-10-12
前言
单细胞转录组测序，指的是以单个细胞为特定研究对象进行转录组测序，并对获得的数据做生物信息学统计分析的方法。
10x Genomics推出的ChromiumTM是基于一套分子条形码和微流控技术的分析系统，由仪器、试剂盒和信息学软件组成，能全面对接Illumina测序仪。该系统对细胞数量选取灵活，可同时获得1000-10000个细胞的表达信息， 根据基因表达数据实现细胞亚群分类与细胞群体间标记物筛选，是细胞群体检测、细胞异质性以及细胞发育分化等研究的方法。
应用方向
10x Genomics单细胞应用广泛，可应用的细胞类型有：生殖细胞、胚胎细胞、神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等。
研究方向
1 人类细胞图谱构建
2 肿瘤异质性研究
3 干细胞发育分化
4 免疫方向研究
5 神经系统发育研究
6 脑发育研究
7 胚胎细胞发育研究
8 疾病分型
技术原理
u 10x Genomics仪器小巧，但功能强大，其技术核心是油滴包裹的凝胶珠（GEM），该系统有75万种barcoded beads，每个bead上有40-80万探针。Barcode（16bp），一个微珠只对应于一种Barcode，通过Barcode区分凝胶微珠。UMI（10bp），是一段随机序列，也就是说每一个cDNA分子，都有自己的UMI序列, UMI的作用是为了区分哪些reads是来自于一个原始cDNA分子。
图1
技术要点
1 通过微流体“双十字”交叉系统用油滴将含Barcoded RT Primers的Gel Beads、细胞和反应试剂包裹成GEMs（Gel Bead in Emulsion），即油包水结构
2 GEMs形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA
3 油滴破碎，cDNA为模板进行PCR扩增，然后进行cDNA打断、加测序接头P5及测序引物R1等传统二代测序的建库过程
4 测序后，得到每个细胞的转录组表达谱，Barcode标记细胞，UMI标记基因并记录表达量
图2（图片来源：10x Genomics Chromium SingleCell3’Solution Application）
操作流程
组织或细胞 → 单细胞悬液制备 → 单细胞转录组建库 → 二代测序 → 数据聚类分析 → 细胞亚群分类
样本准备
细胞类型：新鲜单细胞悬浮液
质量要求：细胞活性90%以上（不含有Ca2+,Mg2+ ），浓度500-2000cell/μl，起始量大于105个
细胞运输：细胞保存于冻存液中，利用干冰/液氮运送
信息分析
Cell RangerTM分析流程，是10x Genomics针对ChromiumTM单细胞转录组测序开发的完整分析流程，该流程能进行细胞聚类、差异基因筛选、差异基因功能分析和细胞发育分化轨迹分析（图3、4、5、6）等。
分析流程
测序数据质量统计（比对基因组、基因表达定量）→ 细胞过滤与标准化→ 细胞亚群分类 → 差异基因筛选 → 差异基因功能分析（GO、KEGG）→ 标记基因筛选
图3 细胞亚群分类 (Matthew et al, 2018)
图4 已有标记基因或差异基因筛选(Matthew et al, 2018)
图5 差异基因功能分析
图6 细胞发育分化轨迹(Matthew et al, 2018)
技术优势
高通量、短周期、低成本、适用范围广
一次可以测8个样本，每个样本最多可获得10000个细胞转录组数据
每个样本通道10分钟内完成1000-10000个细胞制备
一个油珠包含2个细胞的几率低（Low Doublet Rate）：0.8%/1000个细胞
单个细胞捕获率高达65%，细胞基因表达获取高效精准
周期短，快的一天内完成文库构建
与传统人工细胞分离方法相比，价格更优
对细胞类型和大小几乎无限制，已成功应用于肿瘤细胞异质性研究、免疫细胞分型和疾病分型等领域
文献总结
年份 | 期刊 | 影响因子 | 研究方向 |
2018.8 | Science | 31.853 | 人肾肿瘤细胞鉴定和组成识别 |
2018.2 | Cancer Research | 9.122 | 肿瘤内皮细胞 |
2017.12 | Nature Communications | 12.124 | 乳腺上皮细胞 |
2017.5 | Nature | 40.137 | 小肠干细胞 |
2017.4 | Nature Method | 25.062 | 外周血单核细胞 |
2016.12 | Cell | 30.409 | CRISPR与10x Genomics单细胞转录组结合 |
