2018-10-24
发表期刊：Science
研究简介
癌细胞的身份是通过形态学、组织背景和标记基因表达来定义的。单细胞转录组在mRNA的全面和定量读取基础上细化了细胞的身份。精细的细胞转录组分析可以揭示一个肿瘤细胞的起源以及支持恶性转化的转录轨迹。
信使RNA编码细胞功能并产生表型。在人类癌症的背景下，它定义了恶性细胞的身份和肿瘤组织的多样性。本文对来自人肾肿瘤和胎儿、儿科和成人肾脏正常组织的72501个肾肿瘤细胞进行单细胞转录组分析。将儿童肾母细胞肿瘤与特定的胎儿细胞类型进行匹配，为假设肾母细胞肿瘤是异常的胎儿细胞提供证据。在成人肾细胞癌中，鉴定出一个典型癌症转录本，它与鲜为人知的近似复杂的上皮细胞亚型（subtype of proximal convoluted tubular cell）匹配。本文对肿瘤成分的分析确定了与癌症相关的正常细胞。文章结果发现可以精确的进行人肾脏肿瘤的鉴定和组成识别。
研究方法
方法平台：10Xgenomics 单细胞转录组测序， Illumina HISEQ 4000
实验设计：
实验对象 | 例数（例） | 总细胞数（个） |
肾母瘤细胞 | 3 | 72501 |
透明肾细胞癌(ccRCC) | 3 | |
乳头状肾细胞癌(pRCC) | 1 | |
健康胎儿 | 2 | |
儿童 | 3 | |
青少年 | 2 | |
成人 | 5 | |
输尿管 | 4 |
研究结果
3.1微滴质量控制和细胞单元分配概述
将得到的125139个unique barcodes的细胞通过质量控制，去除含有少于200个genes，线粒体基因表达超过20%细胞和利用标记组合检测可能是相同亚群的细胞后得到72501个细胞，进一步将72501个胎儿、正常和肿瘤细胞分成免疫和非免疫细胞室（图1）。
图1
3.2 正常人肾的典型细胞类型
非免疫细胞中，在42809个非恶性细胞中，37951个成熟肾细胞代表肾单位不同显微解剖区域的上皮细胞，t-SNE非线性聚类的方法和已知细胞标记基因展示其中近端小管细胞占很大比例(图2，A～C)。此外，还有成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管内皮细胞(肾小球内皮和上升和下降的直肠血管)(图2D)
图2
3.3 胎儿细胞类型与肾脏发生
同样t-SNE非线性聚类的方法显示胎儿细胞（4858个）分为发育期肾单位[输尿管芽（UB）、帽间质细胞（CM）和原始囊泡（PV）细胞]和成纤维细胞、肌成纤维细胞、血管内皮细胞和神经节细胞（图3，A至C）。细胞类群中肾发生基因的表达阐明肾单位的发育。肾单位的形成是从UB产生的，它导致上面的间质凝结成CM。然后CM形成PV即肾小球的前体。管状系统从胎儿肾单位的UB和PV两端生长。为了确定肾脏发生的转录程序，本文鉴定了在UB细胞对应CM和PV细胞中差异表达的转录因子，结果显示转录因子的表达在伪时间轨迹上显著变化（图3D）。这些分析确定了与肾单位发育相关的已建立的和先前未知的转录因子，包括为随后恶性肿瘤分析提供参考。
图3
3.4 儿童肿瘤细胞与正常胚胎细胞比对分析
建立起健康肾的单细胞全景后，对来自肿瘤的6333个非免疫细胞和17821个免疫细胞进行研究（Wilms tumor, ccRCC, and pRCC)。结合基因分型和相似性分析，本文研究发现肾母细胞与正常胎儿细胞相似，来自肿瘤的肌成纤维细胞与来自成熟肾脏和胎儿肾脏的肌成纤维细胞相似性高，表明肾母细胞代表异常胎儿细胞，。与UB和PV细胞比对发现了差异的肾母癌细胞群（特定发育中的肾单位亚群）（图4A）。为了验证肾母癌细胞的细胞身份，本文对124个肾母癌细胞的一个独立系列进行转录组查询从而找到UB和PV的细胞特征，提取了在肾母癌细胞的UB或PV细胞中表达和在非肿瘤细胞中未表达的特异性标记，证实这些细胞在肾母肿瘤中的存在，PV和UB细胞的特征可见于肾母肿瘤和正常胎儿组织，并且局限于肾母肿瘤和正常胎儿组织（图4B）。肾母肿瘤细胞的伪时间发育显示出来自UB的两个转录程序：一个分支主要描述肾源性剩余细胞的发育，另一个分支主要描述肾母癌细胞的发育（图4C）。这两个程序中的转录因子（图4D）和正常肾形成的转录因子显著重叠（P＜10-4；超几何检验），这表明肾母癌细胞的发育来自于正常肾形成过程。该研究揭示了肾母细胞的可塑性并且来源于胎儿细胞的身份并且从转录水平上定义了发育细胞状态和轨迹，这些状态和轨迹可能具有可靶向的脆弱性。
图4
3.5成人肿瘤与正常成熟肾细胞相匹配
接下来本文研究了ccRCC和pRCC（类型1）。将ccRCC和pRCC与正常成熟细胞匹配，发现它们保留了PT1细胞亚群的转录特征， PT1细胞亚群是卷曲近端管状细胞的一种特殊亚型（图5A）。为证实RCC中PT1标记物的身份，利用观察结果，即PT1细胞是由SLC17A3和VCAM1定义的，本文数据中没有SLC7A13。VCAM1表达在肾小管近端PT1特异性表达（P<10_4；Mann-Whitney试验）（图5B）。共聚焦显微镜显示VCAM1和SLC17A3在CA9+细胞中定位，CA9是ccRCC细胞的特异性标志物（图5C）。从三个人组织检测，确定了Ca9+ VCAM1+近端肾小管细胞亚群（图5D）。这些观察证实PT1细胞是ccRCC细胞最近的正常相关细胞。在ccRCC和pRCC中都存在PT1标记可能表明这些肿瘤分歧的命运的共同起源。
图5
总结
通过识别肾癌细胞特定的相关的正常细胞，这项研究将我们对这些恶性肿瘤的理解超越了“非胎儿性”的概念或从近似的微解剖区域到精确的细胞、分子定量分辨率。该研究发现将儿童早期肾母细胞瘤的发病高峰描绘为胎儿肾脏发生的腐败，与成熟肾脏中肾癌的终生发展形成对比。该研究提供了一个可扩展的实验策略，用于确定人类癌细胞的身份。
参考文献
Young M D, Mitchell T J, Braga F A V, et al. Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors[J]. Science, 2018, 361(6402): 594-599.
