2017-09-27
研究背景
m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，意味着mRNA甲基化参与了多种生物学过程，如干细胞分化、生物节律等。最近新发现的m6A 识别蛋白YTHDF2可以对 m6A 去甲基化。
哺乳动物早期胚胎发育过程中，胚胎中许多蛋白的产生依赖于来自母源的mRNA调控的基因表达，但是在经历母体-合子过渡（maternal-to-zygotic transition）期间后，胚胎将激活自身的基因组从而产生变化，此后大量来自母源的mRNA将被迅速清除。斑马鱼ythdf2在早期胚胎中普遍表达。本研究通过在斑马鱼发育早期阶段使ythdf2丧失功能来检测m6A 依赖性RNA是否减少。
研究结果
实验表明，纯合的第一代ythdf2-/-斑马鱼突变体没有产生表型，但将纯合的第一代ythdf2-/-斑马鱼进行杂交时发现大约有超过70%的后代无法发育通过第一个细胞期，然后进一步发现这种致死可能是由于纯合ythdf2-/-雄性斑马鱼的精子缺陷导致。
图1.斑马鱼早期胚胎样本构建
利用m6A-seq发现，40% 的基因转录本存在m6A位点，超过36%的母体基因具有m6A甲基化位点。受精后4h之前，甲基化基因比非甲基化基因丰度更高且主要富集在磷代谢和细胞周期调控功能上。
图2.未甲基化基因与甲基化基因比对
图3.甲基化基因GO富集分析
进一步研究发现，与野生型相比，受精后4h时，ythdf2−/−胚胎中mRNA的m6A甲基化修饰提高了50%以上，证明Ythdf2会影响母体mRNA的甲基化。而且它们的清除会因为YTHDF2的缺失而受阻。对受精后4h时间点下母体ythdf2−/−样本进行测序分析，共发现3292个基因高表达并存在甲基化，其中超过60%为母体基因。经过筛选，其中135个基因为共有基因，这些共有基因主要富集在磷代谢、细胞周期过程和繁殖过程中。
图4.受精后4h时间点利用不同测序技术发现的m6A甲基化修饰转录本
图5.共有基因GO富集分析
图6.RNA甲基化motif
研究结论：
本研究表明，m6A甲基化修饰在早期胚胎发育中具有非常关键的作用。超过三分之一的斑马鱼母本mRNA可以通过N6甲基腺苷（m6A）进行修饰调控，而且这些母本mRNA清除过程也是通过m6A结合蛋白Ythdf2完成的。在斑马鱼胚胎中去除Ythdf2，会减缓了m6A修饰母本mRNA的衰变，并且阻止合子基因组激活。胚胎无法及时启动MZT，就会引发细胞周期停顿，导致发育延迟。
目前对m6A的转录组研究方法为MeRIP-seq（mRNA甲基化测序）的方法，其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析，即可在转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。
参考文献：Zhao B S, Wang X, Beadell A V, et al. m(6)A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition.[J]. Nature, 2017, 542(7642):475.
