2019-02-14
转录组结果出来后往往会做QPCR验证，但结果验证不上就让人苦恼了，下面咱们就好好分析一下验证不上的原因。
1. 基因选的是否合适？
首先，验证挑选的基因个数不能太少。其次，QPCR验证一般选择转录组结果中的差异基因，差异倍数根据生物学重复数量可进行调节，比如三个重复的需要差异在2倍以上，5-10个重复的差异倍数可以适当降低，重复数大于10的也可以只考虑P值。另外，应避免选择表达量过低的基因。一般在有生物学重复的情况下，要求组内三个生物学重复的read count >=10；FPKM值至少在一个组大于1。
2. 样本选的有没有代表性？
当一个组的生物学重复比较多的时候，往往只会选取部分样本做QPCR，但要注意同一基因在不同样本个体间的表达也是有差异的，所以选择的样本就要求能代表组内的整体情况，排除基因在样本间的特异性。
3. 引物设计的是否合理？
在RNA-Seq中大多数基因会包含不止一个转录本，甚至有一些特别复杂的转录本形式，如果设计引物不合理就会使QPCR结果不准，还可能会有假基因的干扰。所以，QPCR的引物尽可能全都设计在基因的转录本共有外显子上，别是某些特定转录本的；引物设计好以后可以到NCBI做Primer Blast，保证引物不会Blast到一些基因组上的假基因上，避免假基因表达的干扰。
4. 转录组和QPCR的RNA是同一批次吗？
RNA表达具有时间和空间的特异性，所以不同时刻或者是同一时刻不同组织内RNA表达的数目都有着较大的差别，不同批次样品的RNA表达也会有所不同，而且即使是同一批样本，保存时间与保存方式不同也会对RNA造成影响。因此做QPCR验证的RNA需要与做转录组的RNA来源保持一致，间隔的时间也尽量不要太久。
5. 样品的关系是否弄反？
一般QPCR验证不上可能是部分基因验证效果不好，但如果QPCR结果与转录组的结果很明显不一致，绝大部分基因上下调关系相反，就要考虑样品弄反的可能性。可能是转录组实验分析中导致样品弄反，也有可能是做QPCR过程中弄反了样品，需要进一步核实确定了。
除了以上提到的因素，QPCR实验操作要求也比较严格，否则是失之毫厘差之千里，所以千万要注意。大家还需要知道，转录组测序与QPCR定量虽然都看基因表达，但是他们确实两种不一样的方法，会有很大概率的不一致，要做好心理预期。
新年伊始，这篇小软文就教教大家在转录组测序的QPCR验证中如何避避坑，告别验证烦恼。
