2019-08-27
CircRNA（环状RNA）是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，通过特殊的选择性剪切产生封闭环状结构的非编码RNA，可与miRNA结合，起到miRNA海绵作用（miRNA sponge），在疾病中发挥着重要的调控作用，是继miRNA后RNA领域新的研究热点。利用高通量测序技术，对生物样本中的CircRNA进行鉴定、表达丰度检测及结构分析，可以推动更深入的基因表达调控研究。随之而来的对于高通量结果的后期验证手段，也是科研工作者们极为关心的内容，以下将对不同的验证手段展开说明。
目前常用的几种CircRNA的鉴定及功能验证方法主要包括：qRT-PCR定量验证、Northern blot验证、过表达（正向验证）、基因沉默（反向验证）。
qRT-PCR定量验证
qRT-PCR法进行CircRNA定量验证是比较常用的验证方法，该技术的关键在于反向引物的设计，其核心是构建包含反向剪切位点的引物设计序列。CircRNA全长调取及引物设计方法详述如下：
1.在研究CircRNA时，主要利用Circbase数据库 (
http://www.Circbase.org/)获得CircRNA的序列；
2.将网页中的 Circ sequence 选项更改为“spliced”，再点击 “search”，即可下载CircRNA的全长序列信息；
3.点击fasta下载序列；
4.针对上述序列，即可设计CircRNA的全长序列设计引物，设计方法与常规基因引物设计类似，但重点是设计引物时的位置，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除跨环状RNA引物剪切点（backsplice junction）处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，称之为divergent primer（见图1）。
图1：convergent primer vs divergent primer
此外，为了增强circRNA的验证效率，一般要求起始模板尽量需满足以下要求（3 free）：
1. DNA free；
2. rRNA free；
3. linearRNA free。
所以可以在验证前期进行DNase处理total RNA，然后用RNase R去除线性RNA，最后再进行验证。
Northern blot验证
探针的设计是验证成功的关键因素， 对于内含子环化CircRNA，可以根据内含子序列设计探针（图2 a）；对于外显子环化产生的CircRNA，尽可能跨越backsplice junction位点设计探针（图2 b）。验证策略：对free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。
图2. CircRNA定量验证引物设计示意图
过表达（正向验证）
CircRNA的成环机制有很多，其中基于CircRNA侧翼的反向互补序列（Alu序列）是目前公认的一种成环机制。因此我们可以通过PCR扩增目标区域（包含CircRNA侧翼的Alu元件或者内部的碱基互补序列）、根据限制性酶切位点进行酶切并连接到载体上；过表达载体转染；定量PCR检测转染效率；divergent primers鉴定CircRNA过表达倍数等技术手段验证CircRNA。过表达策略：
⑴ 扩增目标区域包含CircRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；⑵目标区域扩增基于基因组DNA为模板。
基因沉默（反向验证）
和过表达策略相反，我们可以通过siRNA干扰封闭CircRNA的功能。CircRNA敲除思路主要针对CircRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化CircRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰（图3）。
图3.基于siRNA敲除策略
